Иммуноцитохимическая представляет собой мощный метод для определения присутствия, субклеточные локализации, а также относительное содержание антигена интереса к культуре клеток. Этот протокол представляет простой в последующей серии шагов, которые позволяют сохранить антител и получить максимальную отдачу от своих пятен.
Abstract
Иммуноцитохимическая это очень мощный и достаточно простой метод для определения присутствия, субклеточные локализации, а также относительное содержание антигена интересов, чаще всего белка в культуре клеток. Этот протокол представляет простой в последующей серии шагов, что позволит исследователям сохранить первичные и вторичные антитела, получая высокое качество, воспроизводимые качественных и количественных данных из их окрашивания. Есть два аспекта этого протокола, который поможет сохранить объемы антитела необходимы для окрашивания. С одной стороны, клетки выращивают на небольших, круговые покровные, которые размещаются в лунках планшета для культуры ткани. После фиксации клеток на покровных могут быть удалены из скважин пластины. Для окрашивания антителами, покровное с клетками инвертируется на небольшую каплю раствора антител на парафильмом и покрыт второй кусок парафильмом для предотвращения высыхания. Используя этот метод, только ~ 25 мкл антител решения, необходимые для каждого покровное (или образец), чтобы быть окрашены. Этот протокол описывает иммуноокрашивания из человеческих стволовых нейронных / клеток-предшественников (hNSPCs), но может использоваться и для многих других типов клеток.
Protocol
День 1: Подготовка немецких Покровные стекла и посевные клетки Примечание: немецкий покровные стекла часто предпочтительнее для культивирования первичных нервных стволовых клеток и нейронов. Мы используем следующий протокол очистки для улучшения адгезии клетки и …
Discussion
Этот протокол описывает процедуру иммуноокрашивания hNSPCs, что сводит к минимуму объем антител необходимо и дает надежные окрашивания клеток. Процедура, как описано, что лучше для внутриклеточных антигенов, но может быть изменен, чтобы пятно молекул клеточной поверхности, а также для усиления окра…
Acknowledgements
Авторы хотели бы выразить признательность д-р Филип Х. Шварца о человеческом нейронных ресурсов стволовых клеток в детской больнице, Orange County научно-исследовательский институт для обеспечения hNSPC культур и доктор Гари Bassell в Университете Эмори для начального обучения в технике окрашивания парафильмом.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips
Tool
Carolina Biological Supply Company
WW-63-3029
12,15,18, 22, 25 mm coverslips available
Liquinox phosphate-free detergent
Reagent
Sigma
Z273279
very viscous
Poly-D-lysine hydrobromide
Reagent
Sigma
P7280
Laminin, natural mouse
Reagent
Invitrogen
23017-015
EMEM (1X)
Reagent
Mediatech
MT-10-010-CV
Distributed by Fisher under the indicated catalog #
24 well plate
Tool
Fisher
08-772-1
Triton X-100
Reagent
Fisher
BP151-500
very viscous
Paraformaldehyde
Reagent
Sigma
P6148
potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form
Flanagan, L. A., Ziaeian, B., Palmer, T., Schwartz, P. H., Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. Immunocytochemical analysis of stem cells.In Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. , (2007).