, In vitro olarak insan nöral kök / prekürsör hücrelerinin (hNSPCs) manipüle etme yeteneği, tedavi amaçlı hücre nakli olarak kendi programını araştırmak için insan sinir gelişimi ve keşfetmek için sağlar. Bu protokol, insan kök hücre araştırmalarının giderek tekrarlanabilirlik umuduyla kültür ve Pasajlanması hNSPCs bir yöntem sunmaktadır.
Abstract
In vitro insan sinir kök / prekürsör hücrelerinin (hNSPCs) manipüle etme yeteneği, tedavi amaçlı hücre nakli olarak kendi programını araştırmak için yanı sıra birçok temel insan sinir gelişimi ve patoloji süreçleri keşfetmek için bir araç sağlar. Bu protokol, bu tekniğin standartlaştırılması ve insan kök hücre araştırmalarının tekrarlanabilirlik artan umutlar, kültür ve Pasajlanması hNSPCs basit bir yöntem sunuyor. Kullandığımız hNSPCs Ulusal İnsan Nöral Kök Hücre Kaynağı kadavra postnatal beyin korteks izole ve şişeler yapışık kültürler fibronektin (Palmer ve ark, 2001; Schwartz ve ark, 2003) ile kaplı olarak yetiştirilir. Biz bir DMEM kültür bizim hNSPCs: F12 serum ücretsiz medya EGF, FGF ve PDGF ile desteklenmiş ve geçit onları 01:02 yaklaşık her yedi gün. Kültür hücrelerin çoğunluğunu kullanarak, bu koşulları, iki kutuplu bir morfoloji korumak ve farklılaşmamış nöral kök hücreler (örneğin nestin ve sox2) belirteçleri ifade.
Protocol
Not: Haftada bir kez, bizim hNSPCs rutin kültür için, biz her gün ve medya genellikle geçit 01:02 50-100% değişim . F12 baz medya: kültür ortamı% 20 BIT 9500 DMEM, 1X antibiyotik / antimikotik ve büyüme faktörleri (EGF, FGF ve PDGF her 40 ng / ml) içerir. Kaplamalı Flask hazırlanması ve Hücreler Dissociating 37, 10 mikrogram / ml insan fibronektin gecede 4 saat, ya da için EMEM geçişli hücreler, mont T25 şişeler ° C doku kültürü inkübatör içi…
Discussion
Biz bu protokolü hNSPCs güvenilir kültürleri sağlar bulduk. Bir kritik bir faktör hücreler için oldukça yoğun kültür olarak tutulacak ve hücrelerin seyrek olduğu noktaya geçişli olamaz ihtiyaç vardır. Bizim ellerde, seyrek kültürleri çok yavaş büyür ya da tamamen bölen ateşkes. Bu nedenle, bir kültürün son derece yoğun olduğu için, genellikle kültürler 1:2 veya 01:03 bölünmüş. Iyi hücre eki ve göç teşvik eden, ancak, laminin aksine, aynı zamanda hücreleri ayırmak için Hücre Ayrılma Tampon (CDB…
Acknowledgements
Yazarlar, minnetle, Çocuk Hastanesi, kendi kültür hNSPCs ve ilk öğretim sağlamak için Orange County Araştırma Enstitüsü Ulusal İnsan Nöral Kök Hücre Kaynağı Dr. Philip H. Schwartz kabul etmiş sayılırsınız.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
BIT-9500 (BSA, Insulin, Transferrin)
Reagent
Stem Cell Technologies
09500
Antibiotic-Antimycotic
Reagent
Invitrogen
15240-062
DMEM:F12 (1X)
Reagent
Invitrogen
11330-032
EMEM (1X)
Reagent
Mediatech
MT-10-010-CV
Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Fetal Bovine Serum
Reagent
Invitrogen
10437-028
FGF, human basic recombinant
Reagent
Peprotech
100-18B
PDGF-AB
Reagent
Peprotech
100-00AB
EGF, human recombinant
Reagent
BD Biosciences
CB40052
Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Cell Culture Flask, 25 cm2
Tool
Corning
10-126-28
Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Fibronectin, human, natural
Reagent
BD Biosciences
CB40008A
Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Human Neural Stem/Precursor Cells
Cells
National Human Neural Stem Cell Resource http://www.nhnscr.org/default.htm
Nethercott, H. N., Maxwell, H., Schwartz, P. H., Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. Neural stem cell culture.Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. , (2007).