La capacidad de manipular humana madre neurales / células precursoras (hNSPCs) in vitro permite investigar su utilidad como los trasplantes de células con fines terapéuticos y para explorar el desarrollo neuronal humano. Este protocolo presenta un método de cultivo y hNSPCs pases con la esperanza de la reproducibilidad de cada vez mayor de la investigación con células madre humanas.
Abstract
La capacidad de manipular humana madre neurales / células precursoras (hNSPCs) in vitro constituye un medio para investigar su utilidad como los trasplantes de células con fines terapéuticos, así como para explorar muchos de los procesos fundamentales del desarrollo humano y la patología neuronal. Este protocolo presenta un método simple de cultivo y hNSPCs pases con la esperanza de la normalización de esta técnica y el aumento de la reproducibilidad de la investigación con células madre humanas. El hNSPCs usamos fueron aislados de cadáveres corteza cerebral postnatal por el Instituto Nacional de Recursos Humanos de las células madre neurales y crecido como adherente culturas en frascos recubiertas con fibronectina (Palmer et al, 2001;.. Schwartz et al, 2003). Nosotros la cultura de nuestro hNSPCs en DMEM: F12 medio libre de suero suplementado con EGF, FGF y PDGF y el paso de las 1:02 aproximadamente cada siete días. Usando estas condiciones, la mayoría de las células en el cultivo mantienen una morfología bipolar y expresan marcadores de células madre indiferenciadas neural (como la nestina y Sox2).
Protocol
Nota: Para el cultivo de la rutina de nuestra hNSPCs, podemos cambiar el 50-100% de los medios de comunicación cada dos días y por lo general les paso 01:02 una vez por semana. La cultura de los medios de comunicación contiene un 20% BIT-9500, 1X factores de antibiótico / antimicótico, y el crecimiento (EGF, FGF y PDGF cada uno a 40 ng / ml) en DMEM: F12 medios de base. Preparación del frasco recubiertas y disociar las células Para preparar nuevos frascos para las c…
Discussion
Hemos encontrado que este protocolo ofrece culturas fiable de hNSPCs. Un factor crítico para nuestras células es que tienen que ser lo bastante denso y las culturas no pueden ser pasados al punto de que las células son escasas. En nuestras manos, culturas escasa crecen muy lentamente o desaparecen completamente división. Por esta razón, se suelen dividir nuestras culturas 1:2 o 1:3 cuando la cultura es extremadamente denso. Revestimiento de la superficie de una placa de cultivo con fibronectina es importante, ya que promueve la u…
Acknowledgements
Los autores agradecen el Dr. Philip H. Schwartz de la Comisión Nacional de Recursos Humanos de las células madre neurales en el Hospital de Niños del Condado de Orange el Instituto de Investigación para proporcionar hNSPCs y la instrucción inicial en su cultivo.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
BIT-9500 (BSA, Insulin, Transferrin)
Reagent
Stem Cell Technologies
09500
Antibiotic-Antimycotic
Reagent
Invitrogen
15240-062
DMEM:F12 (1X)
Reagent
Invitrogen
11330-032
EMEM (1X)
Reagent
Mediatech
MT-10-010-CV
Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Fetal Bovine Serum
Reagent
Invitrogen
10437-028
FGF, human basic recombinant
Reagent
Peprotech
100-18B
PDGF-AB
Reagent
Peprotech
100-00AB
EGF, human recombinant
Reagent
BD Biosciences
CB40052
Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Cell Culture Flask, 25 cm2
Tool
Corning
10-126-28
Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Fibronectin, human, natural
Reagent
BD Biosciences
CB40008A
Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Human Neural Stem/Precursor Cells
Cells
National Human Neural Stem Cell Resource http://www.nhnscr.org/default.htm
Nethercott, H. N., Maxwell, H., Schwartz, P. H., Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. Neural stem cell culture.Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. , (2007).