Генотипическая вывода ВИЧ-1 тропизм Использование Популяционные Секвенирование V3

Summary

ВИЧ тропизм может быть выведено из V3 области вирусной оболочки. V3 является ПЦР усиливается в трех экземплярах с использованием вложенных RT-PCR, последовательность и интерпретируются с использованием биоинформатики программного обеспечения. Образцы с с 1 или более последовательности (ы) с низкими оценками G2P классифицируются как-R5 вируса.

Abstract

Справочная информация: До получения препарата из CCR5-антагонистов класса в области ВИЧ терапии, пациент должен пройти тест на ВИЧ тропизм, чтобы подтвердить, что его вирусным население использует CCR5 coreceptor для сотовых запись, а не альтернативные coreceptor. Один из подходов к тропизм тестирования является проверка последовательности V3 области ВИЧ конверт, который взаимодействует с coreceptor.

Методы: Вирусная РНК извлекается из плазмы крови. V3 регионе усиливается в трех экземплярах с вложенными обратной транскриптазы-PCR. Амплификации затем последовательно и проанализированы с помощью программного обеспечения, RE_Call. Последовательности затем представляются на биоинформатики алгоритм, как например geno2pheno сделать вывод о вирусной тропизм от V3 регионе. Последовательности выводятся быть не-R5, если их geno2pheno ложных срабатываний падает ниже 5,75%. Если какой-либо одной из трех последовательностей из образца выводится быть не-R5, пациент вряд ли будет реагировать на CCR5-антагонистов.

Protocol

Порядок действий: 1. Добыча: По крайней мере, 500 мкл плазмы крови необходимо как образец ввода для этого генотипической тест тропизм ВИЧ. Извлечение РНК ВИЧ из 500 мкл плазмы использованием easyMAG (bioMérieux) автоматизированных экстрактор, или предпочтительный метод извлечения вашей лаборатории. Элюировать извлеченные вирусной РНК в 60 мкл. Хранить при температуре -20 градусов по Цельсию или начать обратной транскриптазы-PCR сразу после извлечения. 2. RT-PCR: 4μL образца экстракт будет усиливаться в трех экземплярах с использованием вложенных RT-PCR методов. RT-PCR реакция должна быть создана в ПЦР-чистой комнате. Рассчитать количество реагентов, необходимых для числа образцов для усиливаются. Следуйте приведенной ниже таблице указывает объемы реагента на 1 реакции. Реагент Объем (мкл) (1X реакции) DEPC очищенной воды 10,56 2x буфера реакции 20 50 сахарозы% и 0,04% бромфенола синий смеси 4 Прямой праймер ориентации региона ВИЧ-V3 0,32 Обратный праймер 0,32 Фермент – Надстрочный III One-Step RT-PCR System с Платиновая ДНК-полимеразы Taq 0,8 Общий 36 Таблица 1. Реагент объемах, необходимых для 1 реакция One-Step RT PCR. Каждый шаг RT-PCR реакции требуется следующий рецепт: 10,56 мкл DEPC очищенной воды 20 мкл 2х буфера реакции 4μL 50% сахарозы и 0,04% бромфенола синий смеси 0,32 мкл прямого праймера ориентации региона ВИЧ-V3 0,32 мкл обратный праймер 0,8 мкл фермента Для общей сложности 36μL за реакцией. Выстроить пример извлечения труб в ряду рядом с пустым, помеченный 96-луночных ПЦР пластины. Использование ретранслятора пипетки внести 36 мкл образца смеси в каждую лунку пластины ПЦР, например, что Есть 3 скважины подготовлены для каждого образца экстракта. * Примечание: Эта процедура должна быть выполнена в трех экземплярах, как минимум, для обеспечения адекватной выборки вирусной популяции. Использование 8-канальный многоканальную пипетку, добавьте 4μL образца экстракт каждой из 3-х скважин. Изменение советы от каждого дополнения. Обложка скважин с ПЦР шапки полосы. Когда передача comlete, место пластину ПЦР в амплификаторе. Установить амплификаторе бежать со следующей программой: 30 минут при 52 ° С 2 минуты при 94 ° C 40 циклов (15 секунд при 94 ° C, 30 секунд при 55 ° С и 1,5 минут при 68 ° C) 5 минут при 68 ° C Удалить ПЦР пластины из амплификаторе. Пластины можно хранить при комнатной температуре. Приступить к второй тур шаг ПЦР 3. Второй раунд ПЦР: Рассчитать количество реагентов, необходимых для числа образцов для усиливаются. Следуйте приведенной ниже таблице указывает объемы реагента на 1 реакции. Реагент Объем (мкл) (1X реакции) DEPC очищенной воды 13,45 60% сахарозы, 0,08% крезола красная смесь 2 Рош HiFi система буфер 2 2 MgCl 2 0,8 дНТФ 0,16 Форвард ПЦР праймера 0,15 Обратный праймер ПЦР 0,15 Развернуть HiFi фермента 0,29 Общий 19 Таблица 2. Реагент объемах, необходимых для 1 реакция 2-го тура ПЦР. Каждый второй раунд ПЦР требует следующий рецепт: 13,45 мкл DEPC очищенной воды 2 мкл 60% сахарозы, 0,08% крезола красная смесь 2 мкл Рош Hifi системы буфер 2 0,8 мкл 25 мМ MgCl 2 0,16 мкл 25 мМ дНТФ 0,15 мкл обоих прямого и обратного праймеров ПЦР 0,29 мкл фермента Развернуть HiFi Для общей сложности 19 мкл на реакцию. <li> В ПЦР-чистой комнате, используя ретранслятор пипетки внести 19 мкл реакционного буфера в каждую лунку в чистую тарелку ПЦР. В комнате усиления сообщение, с помощью 8-канального многоканальной пипетки, передача 1 мкл ПЦР-шаблон на второй тур буфера ПЦР. Изменение советы от каждого дополнения. Обложка скважин с ПЦР шапки полосы и передачи втором раунде ПЦР пластины амплификаторе. Установить амплификаторе бежать со следующей программой: 2 минуты при 94 ° C 35 циклов (15 секунд при 94 ° C, 30 секунд при 55 ° С, 1 минута при 72 ° C) 7 минут при 72 ° C Удалите пластину от амплификаторе после того, как температура вернулась в 25 ° C. 4. Гель-электрофореза: Для того, чтобы подтвердить, что V3 регионе успешно усиливается, шаг гель-электрофореза не выполняется. Подготовка агарозном геле с 0,8 г агарозы порошок в 50 мл буфера 1X TAE. Перемешать и расплава в микроволновой печи в течение ~ 1 минуты или до агарозном полностью не растворится. Добавить 6 мкл SYBR безопасной гель пятна и вихревые перемешать. Налейте раствор в гель лоток, и добавьте достаточно геля гребни для размещения числа ПЦР скважин. Как только гель высохнет, удалить гребни и место гель гель аппарата, убедившись, что он полностью погружен в буфер 1X TAE. Использование 10 мкл пипетки многоканальный, добавьте 8μL каждого образца ПЦР для его собственного благополучия в геле. Обложка ПЦР пластины после амплификации были добавлены в гель. Добавить 6 мкл ДНК лестницу, по крайней мере одну скважину на строку. Выполнить гель аппарата при температуре ~ 100 В в течение ~ 10 минут, убедившись, что группы не убежал геля. Место геля на УФ транс-осветителя и сфотографировать гель. Уэллс с ПЦР-амплифицированной ДНК будет светло, что указывает на успешное усиления. Обратите внимание на всех образцах, где три усилений были успеха. При необходимости повторите RT-PCR для тех образцов с менее 3 уточнениями. Приступить к последовательности 5. Последовательность: После того, как усиливается вирусной кДНК, образцы могут быть подготовлены для секвенирования. Секвенирование реакция должна происходить в пост-усилением комнате. Удалить BigDye из морозильника и последовательности праймеров из холодильника. Пусть BigDye оттаивают при комнатной температуре, не более чем на 1 час. Рассчитать количество реагентов, необходимых для количества образцов для выполнения. Следуйте приведенной ниже таблице указывает объемы реагента на 1 реакции. Реагент Объем (мкл) (1X реакции) BigDye 0,3 BigDye буфера 2,1 Грунтовка 2,6 Общий 5,0 Таблица 3. Объемы реагентов, необходимых для 1 реакции секвенирования. * Примечание: подготовить отдельный микс для каждого праймера. ** Примечание: BigDye Буфер используется в последовательности реакций могут быть получены следующим образом: смешать 17,5 мл Trizma гидрохлорид буферный раствор (1 М) (pH9.0) и 0,125 мл хлорид магния (1 М). Принесите конечный объем до 100 мл воды с реагентом класса. Это следует хранить при температуре 2-8 ° C. Использование расчетов с 3,3, подготовить последовательности реакции смеси для каждого праймера и вихревые не более чем на 5 секунд. Алиготе в пробирок 0,2 мл полосы. Алиготе 5 мкл реакционной смеси последовательности в соответствующие лунки пластины с использованием многоканальной пипетки. Закройте планшет (ы), содержащий смесь последовательности реакции с Kimwipe и отложите. Подготовка 1:15 разведение усиливается ПЦР-продукта, добавив 180 мкл Бакстер стерильной водой, чтобы оставшийся продукт ПЦР. Внесите 1 мкл разведенного образца на дно лунки пластины, наконечники изменения. По окончании передачи образца, печать пластины с полосой колпачки и вихревые в течение 1 секунды Место пластины в центрифуге. Установить скорость до 145 г, когда скорость вращения достигает 145 г, остановить вращение. Место пластины в амплификаторе (ы) установлен в следующей программе: 25 циклов (10 сек @ 96 ° C, 5 сек при 50 ° С, 55 сек при 60 ° С…) Объем должен быть не менее 6μL . Цикл должен занять около 1,2 часов. Приступить к осадков 6. Осадки: Для «зачистки" вирусный кДНК следующие последовательности реакций, выполнить осаждения этанолом использовании 95% этанола. Получить пластины из амплификаторе и довести до пост-амплитудафикации комнате. Удалить полосу шапки и поместите их в порядок на чистое бумажное полотенце или Kimwipe. Внесите 4μL Рабочей ЭДТА-ацетата натрия Решение стороне каждого образца хорошо. Нажмите пластину осторожно, чтобы ЭДТА-натрия раствор падает на дно колодца. Же советы могут быть использованы, пока они не вступают в контакт образца на дне колодца. * Примечание: рабочее ЭДТА-ацетата натрия, раствор можно приготовить следующим образом: Подготовка 3М ацетата натрия, растворяя 246,1 г ацетата натрия в 1 л воды реагентом класса. Фильтр решение через 0,45 микрофильтр и подготовить 50 мл аликвоты. Подготовка сток ЭДТА-ацетата натрия раствора (1,5 М NaOAc, 250 мМ ЭДТА) путем смешивания равных объемов ацетата натрия (3 м) и раствора ЭДТА (500 мм) рН 8,0. Подготовить рабочий ЭДТА-ацетата натрия решения путем смешивания одной части фондового ЭДТА-ацетата натрия решение с тремя частями реагента класса воды (10 мл + 30 мл). Внесите 40μL охлажденной 95% этанола на противоположные стороны образца скважин и заменить полосу шапки. Печать шапки и вихревые пластине в течение 10 секунд. Нажмите пластину выбить любые пузыри. Место пластины в морозильнике при температуре -20 ° С в течение минимум 30 минут и не более 2 часов. После осадков произошло, удалить пластину из морозильника и поместить в центрифугу на 20 минут при 3700 оборотах в минуту. Снимите соответствующее количество Привет-Ди формамид (Applied Biosystems) из морозильника, чтобы позволить ему оттепели до денатурации. * Примечание: Денатурация полный 96-луночного планшета требуется 960μL формамида HiDi и, следовательно, целесообразно подготовить ~ 1.1mL аликвоты заранее. После вращающиеся пластины удалить и уничтожить полосу шапки. Обратить пластины за контейнер для отходов (например, бен мусора) и переливать супернатант. Избавиться от оставшихся супернатант промокательной перевернутой тарелки на бумажное полотенце. Сложите 2 листов бумажным полотенцем и поместить на поверхности пластины. Место пластины лицом вниз в центрифуге и вращаются на 145 г, останавливая вращение, когда он достигает 145 г. Удалите пластину из центрифуги и проверьте, чтобы убедиться скважин пусты. Внесите 155μL охлажденной 95% этанола в скважинах. Удалите надосадочную в контейнер отходы и пятном на бумажное полотенце и повторите центрифугирование в 4.10. После удаления пластины из центрифуги, отбросить использовать бумажное полотенце и дайте пластины стоять лицом вверх в течение 2-5 минут, чтобы все оставшиеся этанола испариться. Приступить к денатурации 7. Денатурирование Получить талой формамид HiDi и перелить в контейнер, достаточно большой для многоканальной пипетки * Примечание: При использовании предварительно аликвоты меры, как отмечается в 6.7b, одна трубка необходима для каждого 96-луночного планшета для выполнения. Использование многоканальной пипетки, распространять 10 мкл формамида HiDi во все лунки на тарелку, в том числе те, которые являются пустыми. Обложка пластинки с мата перегородками для образования уплотнения. Место пластины в амплификаторе при 90 ° С в течение 2 минут. После денатурации, место пластину в пластине держателя затем загрузить в секвенсор. Добавить подготовленные расположение последовательности. Плиты можно хранить при температуре -20 ° С не более одной недели, прежде чем выполнять последовательность запуска. 8. Анализируя полученные данные использования программного обеспечения базы Calling. Использование ReCall выполнять автоматическую базу вызова, без вмешательства человека, одного покрытия грунтовки является приемлемым. Напомним, это заказного программного обеспечения вызова базы, которые можно найти по следующему адресу: http://pssm.cfenet.ubc.ca/ * Примечание: необходима учетная запись Войти. Для настройки учетной записи, нажмите кнопку «Регистрация» в Логин странице. Как только учетная запись была создана вы можете получить доступ к странице загрузки. После входа в систему, вы можете выбрать образцы файлов для загрузки. Использование просматривать опции вы можете определить местонахождение вашего сырья последовательности данных для загрузки с максимальной загрузкой 20 Мб. * Примечание:… Веб Напомним будет принимать только файлы данных, как ABI и SCF файлов в ZIP, смолы или tar.gz Как только файлы для загрузки были выбраны, выберите ссылку последовательности. В этом случае, убедитесь, что ссылки последовательность имеет значение 'V3. Теперь вы готовы нажать кнопку "данных процесса". Обработанные данные появятся на правой стороне страницы под заголовком "Прошлое Образцы". Каждый запуск или выборочной совокупности обработанных будут помещены в папку помечены датой. Они могут быть повторно помечены, нажав кнопку "Переименовать" кнопку. Щелчок по папке появится список образцов. Те, что красные не смогли, а те, которые зеленые прошли. При нажатии на конкретный образец и "Вид" кнопку, вы сможете проанализировать последовательность. Следуйте инструкциям на правой стороне страницы, чтобы перейти throuGH последовательности. * Примечание: Для этого метода, он приемлем для экспорта последовательностей, которые проходят Напомним (показаны зеленым цветом) автоматически, без ручного вмешательства. Если вас устраивают результаты, которые вы можете выбрать для загрузки прохождение последовательности, нажав кнопку "Скачать". Файлы будут загружены в сжатом виде папки. * Примечание: в разделе "Настройки" можно выбрать загрузку и параметры электронной почты, в том числе тип файла. Образцы не в состоянии производить чистую последовательности трех экземплярах должны быть реамплифицировали в трех экземплярах, из экстракта. Если RePCR не в состоянии обеспечить чистой последовательности, минимум 2 последовательностей является приемлемым для использования в тропизм вывода. 9. Вывод Вирусный тропизм из последовательностей, порождаемых Популяционные Секвенирование использованием Geno2pheno корецептором алгоритма. Последовательности могут быть запущены с помощью сервиса geno2pheno coreceptor по следующему адресу: http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php. Образцы для загрузки могут быть помечены как счел нужным. Из выпадающего меню значение параметра, выберите "оптимизированный отключений на основе анализа клинических данных из MOTIVATE (2% и 5,75% ФПР)" Выберите для загрузки или вставки последовательности для анализа, FASTA файлы являются приемлемыми. Geno2pheno FPR можно интерпретировать следующим образом: G2P FPR> 5,75 является представителем R5-использованием вирусного населения; вероятно, ответят на антагонисты рецепторов CCR5 G2P FPR <5,75 является представителем не-R5 вирусного населения; вряд ли реагировать на CCR5 антагонистами. G2P <2 вряд ли есть какие-либо ответ на CCR5 антагонистами. Если какой-либо одной из трех последовательностей из образца выводится быть не-R5, пациент не может ответить на CCR5-антагонистов. 10. Представитель Результаты Когда протокол выполняется правильно следует ожидать успешного последовательность 2 или 3 повторяет для каждого образца. Отрицательных бежать рядом образцы должны иметь никаких признаков РНК. Большинство последовательности должны "пройти" по basecalling ReCall. На основании распределения R5 и не-R5 в сообществе вирусного населения, большинство из случайно выбранных образцов пациента можно было бы ожидать, чтобы R5-использованием вируса. Поэтому, если проект дизайна предложил бы в противном случае, следует ожидать, чтобы иметь больше R5, чем не-R5 образцов. Таблица 1.) Объемы реагента, необходимые для 1 реакция One Step RT-PCR и В) амплификаторе программы, необходимой для проведения ПЦР-реакции. А) Реагент Объем (мкл) (1X реакции) DEPC очищенной воды 10,56 2x буфера реакции 20 50 сахарозы% и 0,04% бромфенола синий смеси 4 Прямой праймер SQV3F1 0,32 Обратный праймер CO602 0,32 Фермент – Надстрочный III One-Step RT-PCR System с Платиновая ДНК-полимеразы Taq 0,8 Общий 36 * Примечание: SQV3F1 грунтовки последовательность: 5 'GAG ОСО ATT CCC ATA CAT ТАТ TGT 3' CO602 грунтовки последовательность: 5 'GCC CAT АГТ GCT TCC ТГК ТГК TCC CAA ГАА CC 3' Б) Количество циклов Время Температура 1 30minutes 52 ° C 1 2minutes 94 ° C 40 15seconds 94 ° C 30 секунд 55 ° C 1.5minutes 68 ° C 1 5 минут 68 ° C Таблица 2.) Объемы реагента, необходимые для 1 Реакция второго раунда ПЦР и B) амплификаторе программы, необходимой для проведения второго раунда ПЦР. А) Реагент Объем (мкл) (1X реакции) DEPC очищенной воды 13,45 60% сахарозы, 0,08% крезола красная смесь 2 Рош HiFi система буфер 2 2 MgCl <suб> 2 0,8 дНТФ 0,16 Прямой праймер SQV3F2 0,15 Обратный CD4R грунтовки 0,15 Развернуть HiFi фермента 0,29 Общий 19 * Примечание: SQV3F2 грунтовки последовательность: 5 'TGT GCC ОСО GCT ГГТ ТТТ GCG НА 3' CD4R грунтовки последовательность: 5 'ТАТ ААТ TCA СТТ СТС CAA ТТГ TCC 3' Б) Количество циклов Время Температура 1 2minutes 94 ° C 35 15seconds 94 ° C 30 секунд 55 ° C 1 минуту 72 ° C 1 7minutes 72 ° C Таблица 3.) Объемы реагента, необходимые для 1 реакции секвенирования и B), программы амплификаторе необходимо проводить секвенирование реакции. А) Реагент Объем (мкл) (1X реакции) BigDye 0,3 BigDye буфера 2,1 Грунтовка Форвард V3FO2F Обратный SQV3R1 2,6 Общий 5,0 * Примечание: Не смешивайте праймеров; отдельные смеси должны быть подготовлены для каждого праймера V3O2F грунтовки последовательность: 5 'ААТ GTC AGY ACA GTA CAA TGT ACA C 3' SQV3R1 грунтовки последовательность: 5 'ГАА ААА TTC ЦКТ TCC ACA ATT AAA 3' Б) Количество циклов Время Температура 25 10 секунд 96 ° C 5 сек 50 ° C 55seconds 60 ° C

Discussion

Метод, представленный здесь, стандартный метод секвенирования применяться к тропизм тестирования. Клинического применения ВИЧ конверт петли V3 секвенирования вирусной предсказать тропизм уже до конца был ограниченным. Этот метод был показан, в ретроспективном анализе маравирок (ViiV Healthcare) клинических испытаний, должны быть как минимум в равной степени в состоянии предсказать тропизм вирусных по сравнению с другими проверки анализов используется в клинике.

Есть много преимуществ для проведения анализа генотипической петли V3 для тропизм предсказания. Прежде всего, эта процедура может быть выполнена на любом объекте с оперативным оборудованием секвенирование, значительно увеличивая доступность и сокращение затрат времени на тропизм тестирования. Для сравнения, фенотипические Расширенные Пробирной Trofile Чувствительность (ESTA) (Monogram Biosciences), который служил золотым стандартом для тестирования тропизм, проводится в одном центре в Южной Калифорнии. Дополнительные преимущества включают требование меньше исходного материала и минимально необходимый вирусной нагрузки 500copies/mL. Кроме того, эксплуатационные расходы ведения генотипического анализа являются относительно низкими по сравнению с теми из фенотипического анализа. Использование ReCall программного обеспечения, в частности, устраняет потребность в ручной проверки последовательности, которая, как правило, трудоемкая часть генотипа анализа.

Метод, представленный здесь, довольно просто, без особых шаг перевешивает другое значение. Мы рекомендуем запустить ПЦР и секвенирования в трех экземплярах, чтобы увеличить вероятность захвата видов меньшинством в вирусной популяции образца. Репликация больше трех может быть выполнена, однако мы нашли трем образцам быть одновременно эффективной и надежной. Кроме того, мы предлагаем использовать One-Step обратной транскриптазы ПЦР Kit (Qiagen), которая выполняет как-ПЦР и ПЦР в первом раунде в этой же реакции при сохранении высокой чувствительности и специфичности.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
RNA extraction using NucliSens easyMAG version 1.0
NucliSens easyMAG Magnetic Silica		bioMerieux	cat. # 280133	(48 x 0.6 ml)
NucliSens easyMAG Lysis Buffer		bioMerieux	cat. # 280134	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 1		bioMerieux	cat. # 280130	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 2		bioMerieux	cat. # 280131	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 3		bioMerieux	cat. # 280132	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG version 1.0		bioMerieux
Class II A2 biological safety cabinet
One-Step Reverse Transcriptase PCR and Second Round PCR
DEPC-treated water		Ambion Corp.	cat. # 9922
SuperScrip III One-Step RT-PCR System with Platinum Taq High Fidelty		Invitrogen	cat#12574-035	Kit components used: – SuperScript III RT/ Platinum Taq High Fidelty Enzyme Mix – 2X Reaction Mix (a buffer containing 0.4mM of each dNTP, 2.4mM MgSO4)
Expand High Fidelity PCR System		Roche Diagnostics	cat. # 1 759 078	Kit components used: – Expand High Fidelity Buffer 10X conc. with 15 mM MgCl2 (lids labelled 2) – Expand HF PCR Enzyme Mix (3.5U/μl) – MgCl2 Stock Solution (25mM) (lids labelled 4)
dNTPs: dATP, dGTP, dCTP, dTTP		Roche Diagnostics	cat. # 11969064001	(100 mM)
Sucrose		Sigma	cat. # S0389-500G
Bromophenol blue sodium salt		Sigma	cat.# B5525
Cresol Red		Sigma	cat.# 114472-5G	indicator grade
Thermocycler
Gel Electrophoresis
50X TAE buffer		Invitrogen	cat. # 24710030	(1000 ml)
SYBR Safe DNA gel stain		Invitrogen Life Technologies	cat. # S33102
Agarose (ultra pure)		Invitrogen	cat. # 15510-027
E-Gel Low Range Quantitative DNA Ladder		Invitrogen Life Technologies	cat. # 12373-031
Reagent Grade Type II water
Gel apparatus
Sequencing
ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit		Applied Biosciences	cat. # 4337458	(25000 reactions)
Hi-Di Formamide		Applied Biosciences	cat. # 4311320
Sodium Acetate (NaOAc)		Sigma	cat. # S-2889
EDTA		Sigma-Aldrich	Cat.# 03690-100ML	0.5M, pH=8.0
TRIZMA Hydrochloride Buffer Solution		Sigma	cat. # T-2819	1 M, pH 9.0
Magnesium Chloride (MgCl2)		Sigma	cat. # M-1028	1 M
95% Ethanol
Running Buffer (10X) with EDTA		Applied Biosystems	cat. # 4335613	500 mL
Polymer Pop-7 (25mL) Or Polymer Pop-7 (10mL)		Applied Biosystems	cat. # 44363929 or cat. # 4352759
3700/3730 BigDye Terminator v3.1 Sequencing Standard Kit		Applied Biosciences	Cat# 4336943
Thermocycler
Centrifuge with plate holders
3730xl DNA Analyzer		Applied Biosciences