절차 : 1. 추출 : 혈장 중 적어도 500 μL이 genotypic HIV의 tropism 시험 샘플 입력으로 필요합니다. easyMAG (bioMérieux) 자동 추출기 또는 실험실의 선호하는 추출 방법을 사용하여 플라즈마의 500μL에서 HIV RNA를 추출합니다. 60 μL 나누어지는에 압축을 푼 바이러스 RNA를 Elute. -20 섭씨도 또는 즉시 추출 후 Transcriptase – PCR 거꾸로 시작에 보관하십시오. 2. RT – PCR : 샘플 추출물의 4μL는 중첩된 RT – PCR 방법을 사용하여 세중의에서 증폭됩니다. RT – PCR 반응은 PCR – 깨끗한 방에 설정해야합니다. 증폭하는 샘플의 수를에 필요한 시약의 양을 계산합니다. 한 반응을위한 시약 볼륨을 나타내는 아래의 테이블을 따르십시오. 시약 볼륨 (μL) (1X 반응) DEPC 물을 치료 10.56 2X 반응 버퍼 20 50 %의 자당과 0.04 % bromophenol 블루 믹스 4 HIV V3 지역을 대상으로 전달 입문서 0.32 역방향 프라이머 0.32 효소 – 어깨 III 플래티넘 DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소와 함께 한 스텝 RT – PCR 시스템 0.8 합계 36 원 – 스텝 RT PCR의 1 반응에 필요한 표 1. 시약 볼륨. 각 단계 RT – PCR 반응은 다음과 제조법이 필요합니다 : 10.56 μL DEPC 처리된 물 2X 반응 완충액 20 μL 50 %의 자당과 0.04 % bromophenol 블루 믹스 4μL HIV V3 지역을 타겟팅 앞으로 뇌관의 0.32 μL 반대 뇌관의 0.32 μL 효소 0.8 μL 36μL마다 반응의 총. 빈 옆에 연속 샘플 추출 튜브 최대 라인, 96 자 PCR 플레이트를 표시. 리피터의 피펫을 사용하여 각 샘플 추출을위한 준비 3 우물이있다는 것을 같은, PCR 플레이트의 각 웰 샘플 믹스 36 μL를 추가합니다. * 참고 :이 절차는 바이러스 인구의 적절한 샘플링을 보장하기 위해, 최소한 세중의 수행되어야합니다. 8 채널 멀티채널 피펫을 사용하여 자사의 세 우물의 각 샘플 추출물의 4μL를 추가합니다. 각 또한 사이의 조언을 변경합니다. PCR 스트립 모자와 우물을 커버. 전송 comlete되면 thermocycler에서 PCR 접시를 놓습니다. 다음 프로그램을 실행하는 thermocycler 설정 : 52시 30 분 ° 94에서 C 이분 °의 C – 40 사이클 (94에 15 초간 ° C, 55 30초 ° C와 68 1.5 분 ° C) 오분 68시 ° C thermocycler에서 PCR 플레이트를 제거합니다. 플레이트는 상온에서 저장할 수 있습니다. 두번째 라운드 PCR 단계로 진행 3. 두 번째 라운드 PCR : 증폭하는 샘플의 수를에 필요한 시약의 양을 계산합니다. 한 반응을위한 시약 볼륨을 나타내는 아래의 테이블을 따르십시오. 시약 볼륨 (μL) (1X 반응) DEPC 물을 치료 13.45 60 % 자당, 0.08 % 크레졸 레드 믹스 2 로체 고음질 시스템 버퍼 2 2 MgCl 2 0.8 dNTP 0.16 앞으로 PCR 프라이머 0.15 역방향 PCR 프라이머 0.15 고음질 효소를 확장 0.29 합계 19 표 2. 시약 볼륨이 2 차 라운드 PCR 반응을 위해 1 필요합니다. 각 두번째 라운드 PCR 반응은 다음과 제조법이 필요합니다 13.45 μL DEPC 처리된 물 2 μL 60 % 자당, 0.08 % 크레졸 레드 믹스 로체 고음질 시스템 버퍼 2 개 중 2 μL 25 MM MgCl 2 0.8 μL 25 MM의 dNTP의 0.16 μL 0.15 μL 순방향 및 역방향 PCR primers 모두 0.29 μL 확장 고음질 효소 반응 당 19 μL의 총. <li> PCR – 클린 룸에서, 리피터의 피펫을 사용하여 깨끗한 PCR 플레이트 19 반응 버퍼의 μL 당 우물을 추가합니다. 게시물 증폭 룸에서 8 채널 멀티채널 피펫 사용하여 두 번째 라운드 PCR 버퍼로 RT – PCR 템플릿 1 μL를 전송합니다. 각 또한 사이의 조언을 변경합니다. PCR 스트립 모자와 우물을 커버하고 thermocycler에 두 번째 라운드 PCR 플레이트를 전송할 수 있습니다. 다음 프로그램을 실행하는 thermocycler 설정 : 94시 2 분 ° C의 35주기 (94에 15 초간 ° C, 55 30초 ° C, 72시 일분 ° C) 72시 7분 ° C 온도가 25에 반환 후 thermocycler에서 플레이트를 제거 ° C. 4. 젤 전기 영동 : V3 지역이 성공적으로 증폭되었는지 확인하기 위해 젤 전기 영동 단계가 수행됩니다. 1X 태 버퍼의 50 ML의 아가로 오스 분말 0.8 g와 아가로 오스 겔을 준비합니다. 휘저어와 아가로 오스가 완전히 해소 될 때까지 ~ 1 분 위해 전자 레인지에 녹기. SYBR 안전 얼룩 젤과 섞어 소용돌이 6 μL를 추가합니다. 겔 트레이에 솔루션을 붓고, 그리고 PCR 우물의 수를 수용하는 충분한 젤 빗를 추가합니다. 겔 건조되면, 빗을 제거하고 겔 장치에서 젤 배치, 그건 완전히 1X 태 버퍼에 빠져들되어 있는지 확인하고. 10 μL 멀티채널 피펫을 사용하여 겔에서 자체 물론 각 PCR 샘플의 8μL를 추가합니다. amplifications가 젤 추가되었습니다 후에 PCR 플레이트를 커버. 행 당 적어도 하나의 DNA 사다리 6 μL를 추가합니다. 밴드가 젤을 실행하지 않도록하고, ~ 10 분 ~ 100V에서 젤 장치를 실행합니다. UV 트랜스 – 조명기에 젤 놓고 젤의 사진을 찍을. PCR – 증폭 DNA와 웰스는 성공적인 증폭을 나타내는, 빛이 나타납니다. 세 amplifications 성공했다 모든 샘플을 적어 둡니다. 필요한 경우, 3 amplifications 미만 분들 샘플 RT – PCR을 반복합니다. 순서로 진행 5. 시퀀싱 : cDNA 증폭 바이러스 발생 후, 샘플은 시퀀싱 준비하실 수 있습니다. 순서 반응은 이후 증폭 룸에서 자리를 차지할 것입니다. 냉장고에서 냉동고 및 시퀀싱 primers에서 BigDye를 제거합니다. 일시간보다 더 이상을 위해, 상온에서 해동 BigDye하자. 실행되도록 샘플의 숫자에 필요한 시약의 양을 계산합니다. 한 반응을위한 시약 볼륨을 나타내는 아래의 테이블을 따르십시오. 시약 볼륨 (μL) (1X 반응) BigDye 0.3 BigDye 버퍼 2.1 뇌관 2.6 합계 5.0 표 3. 시약 볼륨 시퀀싱 1 반응을 위해 필요합니다. * 참고 : 각 입문서에 대해 별도의 믹스를 준비합니다. ** 참고 : 시퀀싱 반응에 사용되는 BigDye 버퍼는 다음과 같이 준비하실 수 있습니다 믹스 Trizma 염산염 버퍼 용액 (1 M) (pH9.0)과 마그네슘 염화물의 0.125 ML (1 M)의 17.5 ML. 시약 등급 물 100 ML에 최종 볼륨을 가져와. 이것은 2-8 ° C.에 보관해야 3.3 계산을 사용하여 시퀀싱 반응을 더 이상 5 이상의 초 각각의 프라이머와 소용돌이를위한 믹스를 준비합니다. 0.2mL 스트립 튜브로 나누어지는. 멀티채널 피펫을 사용하여 적절한 판 우물에 반응 믹스를 배열의 나누어지는 5 μL. Kimwipe로 시퀀싱 반응 믹스가 포함된 플레이트 (S) 커버와 따로 설정할 수 있습니다. 나머지 PCR 제품에 백스터 멸균 물 180 μL를 추가하여 증폭 PCR 제품의 1시 15분 희석을 준비합니다. 적절한 판 우물의 바닥에 희석 샘플 피펫 1 μL는 피펫 팁을 변경합니다. 샘플 전송이 완료되면, 1 초 동안 스트립 모자와 소용돌이와 함께 접시를 밀봉 원심 분리기에서 접시를 놓습니다. 회전 속도가 145g에 도달 145g에 속도를 설정 스핀을 중지합니다. 다음 프로그램으로 설정 thermocycler (S)에있는 접시를 장소 : 25주기 (10 초 @ 96 ° C, 5 초 @ 50 ° C, 55 초 @ 60 ° C…) 볼륨이 있어야 할 최소한 6μL . 주기는 약 1.2 시간 정도 소요됩니다. 석출로 이동 6. 강수량 : 에 "청소"시퀀싱 반응 다음과 같은 바이러스 cDNA가 95 %의 에탄올을 사용하여 에탄올 침전을 수행합니다. thermocycler에서 접시를 검색하고 이후 ampli 가져다fication 룸. 스트립 뚜껑을 제거하고 깨끗한 종이 타월이나 Kimwipe에 순서를 배치합니다. 물론 각 시료의 측면에 근무 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) – 아세트산 나트륨 솔루션 피펫 4μL. 부드럽게 때문에 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) – 나트륨 솔루션은 우물의 바닥에 떨어지는 것을 접시를 누릅니다. 그들은 잘 하단의 샘플을 접촉하지 않는 같은 팁을 너무 오래 사용할 수 있습니다. * 참고 : 작업 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) – 아세트산 나트륨 솔루션은 다음과 같이 준비하실 수 있습니다 시약 등급 물 1 L에 아세트산 나트륨의 246.1 g을 용해하여 3M의 아세트산 나트륨을 준비합니다. 0.45 마이크로 필터를 통해 솔루션을 필터 50 ML aliquots를 준비합니다. 아세트산 나트륨 (3 M)과 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션 (500 ㎜) 산도 8.0의 같은 볼륨을 혼합하여 주식 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) – 아세트산 나트륨 솔루션 (1.5 M NaOAc, 250 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))를 준비합니다. 시약 등급 물 (10 ML + 30 ML)의 세 부분과 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) – 아세트산 나트륨 솔루션 한개의 주식을 혼합하여 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) – 아세트산 나트륨 솔루션을 작업을 준비합니다. 샘플 우물의 반대편에로 및 냉장 95 % 에탄올의 피펫 40μL는 스트립 뚜껑을 교체하십시오. 뚜껑과 와동 10 초 동안 접시를 밀봉합니다. 모든 거품을 이동시키다하는 접시를 누릅니다. 30 분 2 시간 최대 최소 -20 ° C에서 냉동실에 접시를 놓습니다. 강수량이 발생되면, 3,700 rpm으로 20 분간 원심 분리기에 냉장고와 장소에서 접시를 제거합니다. 이 변성되기 전에 해동 수 있도록 냉장고에서 하이 디 포름 아미드 (응용 Biosystems)의 적절한 금액을 제거합니다. * 참고 : 전체 96 – 웰 플레이트의 변성은 HiDi의 포름 아미드의 960μL가 필요하며 따라서 그것은 사전 ~ 1.1mL aliquots 준비에 유리합니다. 접시를 회전 후 제거하고 스트립 모자를 폐기하십시오. 폐기물 컨테이너 (예 : 쓰레기 빈)와 가만히 따르다 뜨는 동안 접시 반전. 종이 타월에 거꾸로 접시 모래 바닥으로 남아 뜨는 제거. 접시의 표면에 종이 타월 및 장소 2 시트를 접으십시오. 그것이 145g에 도달하면 스핀을 중지, 145g에서 원심과 스핀의 플레이트 있는거야를 놓습니다. 원심 분리기에서 접시를 제거하고 우물이 비어 반드시 확인하십시오. 우물에 차게 95 % 에탄올의 피펫 155μL. 폐기물 컨테이너와 종이 타월에 얼룩에 뜨는를 버리고 4.10에 원심 분리를 반복합니다. 원심 분리기에서 플레이트를 제거시 사용하는 종이 타월을 버리고 접시에 남아있는 에탄올이 증발 수 있도록 2-5분 위해 얼굴을 일어하자. denaturing로 이동 7. Denaturing 멀티채널 피펫 충분히 큰 용기에 해동 HiDi의 포름 아미드 및 가만히 따르다를 검색 * 참고 : 같은 6.7b에 명시된 바와 같이 사전 aliquoted 조치를 사용하는 경우 하나의 튜브가 실행되도록 각 96 – 웰 플레이트가 필요합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 비어있는 것을 포함, 접시에있는 모든 우물에 HiDi의 포름 아미드의 10μL를 배포합니다. 인감 양식에 septa 매트와 접시를 커버. 2 분 동안 90 ° C에서 thermocycler에서 접시를 놓습니다. 변성 다음, 시퀀서에로드 다음 접시 홀더에서 접시를 놓습니다. 준비 순서 배치를 업로드합니다. 플레이트는 최대 시퀀스 실행을 수행하기 전에 일주일위한 -20 ° C에서 보관하실 수 있습니다. 8. 기본 전화 소프트웨어를 사용하여 결과 데이터를 분석. 회수를 사용하면 어떠한 인간의 개입과 전화 자동 기지를 수행, 하나의 뇌관 보험이 허용됩니다. 회수는 다음 URL에서 찾을 수있는 사용자 지정 기본 전화 소프트웨어 : http://pssm.cfenet.ubc.ca/ * 참고 : 계정에 로그인이 필요합니다. 계정을 설정하려면 로그인 페이지에서 "등록"버튼을 클릭하십시오. 일단 계정은 업로드 페이지에 액세스할 수 있습니다 만들었습니다. 로그인하면 업로드에 대한 예제 파일을 선택할 수 있습니다. 최대 20MB의 업로드로 업로드하여 원시 시퀀스 데이터를 찾을 수있는 검색 옵션을 사용합니다. * 참고 :… 웹 리콜은 우편으로 ABI와 SCF 파일과 같은 데이터 파일을 받아, 타르 또는 tar.gz 파일 업로드할 파일이 선택되고 나면, 참조 시퀀스를 선택합니다. 이 경우에는 참조 시퀀스로 설정해야합니다 'V3. 이제 클릭하여 준비 "프로세스 데이터를." 가공 데이터는 제목 아래에있는 페이지의 오른쪽에 나타납니다 "과거 샘플." 처리 각 실행하거나 샘플 세트가 날짜와 함께라는 폴더에 배치됩니다. 이들은 "이름 바꾸기"버튼을 클릭하여 다시 표시하실 수 있습니다. 폴더를 클릭하면 샘플의 목록을 나타납니다. 빨간색하는 사람들은 실패, 녹색으로 이들이 지났죠. 특정 샘플과 "보기"버튼을 클릭하면, 당신은 순서를 검토할 수 있습니다. throu로 이동 페이지의 오른쪽에있는 지침을 따르십시오GH 순서. * 참고 :이 방법을 위해, 그것은 수동 개입없이 자동으로 (녹색 표시) 리콜을 전달 시퀀스를 수출하는 허용됩니다. 당신이 결과에 만족하는 경우를 클릭하여 전달 시퀀스를 다운로드하도록 선택할 수 있습니다 "다운로드합니다." 파일은 압축 폴더에 다운로드됩니다. * 참고 : "설정"아래 당신이 파일 형식을 포함하여 다운로드하고 이메일 옵션을 선택할 수 있습니다. 깨끗한 세중의 시퀀스를 생성 실패 샘플 추출에서 세중의에 reamplified해야합니다. RePCR는 깨끗한 순서를 제공하지 못하면, 2 시퀀스의 최소 tropism의 추론에 사용하기 위해 허용됩니다. 9. Geno2pheno 공동 수용체 알고리즘을 사용하는 인구 기반 시퀀싱에 의해 생성된 시퀀스에서 바이러스성 Tropism을 Inferring. http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php : 시퀀스는 다음 URL에서 geno2pheno coreceptor 서비스를 통해 실행할 수 있습니다. 업로드 샘플 볼 적합으로 표시 수 있습니다. 중요한 설정의 드롭 다운 메뉴에서 '(2 %와 5.75 %의 FPR) 동기에서 임상 데이터의 분석을 바탕으로 최적의 단절 "을 선택합니다 분석을 위해 순서를 업로드하거나 붙여넣을 선택 fasta 파일은 가능합니다. geno2pheno FPR은 다음과 같이 해석될 수 있습니다 : G2P FPR은> 5.75는 R5 – 사용하는 바이러스 인구의 대표, CCR5의 antagonists에 응답할 가능성이 G2P FPR <5.75이 아닌 R5 바이러스 인구의 대표, CCR5의 antagonists에 응답하지 않을 수. G2P <2 CCR5의 antagonists 어떤 반응을 매우 않을 수 있습니다. 샘플에서 세 시퀀스 중 하나가 아닌 R5로 유추하는 경우, 환자는 CCR5 – 길항제에 응답할 가능성이 없습니다. 10. 대표 결과 프로토콜이 올바르게 수행되면 하나가 성공적으로 순서 2 또는 3 각 샘플에 대한 복제 기대한다. 샘플과 함께 실행 제외는 RNA의 징후가 없습니다. 시퀀스의 대부분은 회수하여 basecalling "통과"해야합니다. 지역 사회 내에서 바이러스 인구 R5 및 비 – R5의 분포에 따라 무작위로 선택된 환자 샘플의 대부분은 바이러스를 R5 – 이용 것으로 예상됩니다. 프로젝트 디자인은 별도로 제안 따라서 않는 한, 하나는 비 R5 샘플보다 R5를 기대한다. 표 1.) 한 걸음 더 RT – PCR 및 RT – PCR 반응을 수행하는 데 필요한 B) thermocycler 프로그램의 한 반응에 필요한 시약 볼륨. A) 시약 볼륨 (μL) (1X 반응) DEPC 물을 치료 10.56 2X 반응 버퍼 20 50 %의 자당과 0.04 % bromophenol 블루 믹스 4 앞으로 프라이머 SQV3F1 0.32 프라이머 CO602를 역방향 0.32 효소 – 어깨 III 플래티넘 DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소와 함께 한 스텝 RT – PCR 시스템 0.8 합계 36 * 참고 : SQV3F1 프라이머 순서 : 5 '개그 CCA ATT CCC ATA CAT TGT 두드리는 소리 3' CO602 프라이머 순서 : 5 'CAT GCC AGT GCT TCC TGC TGC TCC CAA GAA CC 3' B) 사이클 번호 시간 온도 1 삼십분 52 ° C 1 이분 94 ° C 40 15초 94 ° C 30초 55 ° C 1.5minutes 68 ° C 1 오분 68 ° C 표 2.) 일초 라운드 PCR의 반응과 두 번째 라운드 PCR 반응을 수행하는 데 필요한 B) thermocycler 프로그램에 필요한 시약 볼륨. A) 시약 볼륨 (μL) (1X 반응) DEPC 물을 치료 13.45 60 % 자당, 0.08 % 크레졸 레드 믹스 2 로체 고음질 시스템 버퍼 2 2 MgCl <suB> 2 0.8 dNTP 0.16 앞으로 프라이머 SQV3F2 0.15 역방향 프라이머의 CD4R 0.15 고음질 효소를 확장 0.29 합계 19 * 참고 : SQV3F2 프라이머 순서 : 5 '3 TGT GCC CCA GCT GGT TTT GCG' CD4R 프라이머 순서 : 5 '문신 AAT TCA CTT CTC CAA TTG TCC 3' B) 사이클 번호 시간 온도 1 이분 94 ° C 35 15초 94 ° C 30초 55 ° C 일분 72 ° C 1 7분 72 ° C 표 3.) 1 시퀀싱의 반응 및 시퀀싱 반응을 수행하는 데 필요한 B) thermocycler 프로그램에 필요한 시약 볼륨. A) 시약 볼륨 (μL) (1X 반응) BigDye 0.3 BigDye 버퍼 2.1 뇌관 앞으로 V3FO2F SQV3R1를 역방향 2.6 합계 5.0 * 참고 : primers를 결합하지 마십시오 별도의 혼합은 각 프라이머 대한 대비를하셔야 할 것입 V3O2F 프라이머 순서 : 5 'AAT GTC GTA CAA ACA AGY TGT ACA C 3' SQV3R1 프라이머 순서 : 5 'GAA AAA TTC CCT TCC ACA ATT AAA 3' B) 사이클 번호 시간 온도 25 10초 96 ° C 오초 50 ° C 55초 60 ° C