ويمكن الاستدلال على فيروس نقص المناعة البشرية من المنطقة tropism V3 من المغلف الفيروسية. V3 هو تضخيم PCR من ثلاث نسخ باستخدام المتداخلة RT – PCR ، متسلسلة ، وتفسيرها باستخدام البرمجيات بيوينفورمتيك. وتصنف مع عينات مع تسلسل 1 أو أكثر (s) مع عشرات g2P منخفضة غير R5 الفيروس.
خلفية : قبل حصوله على المخدرات من فئة CCR5 – المتناحرين في علاج فيروس نقص المناعة البشرية ، يجب على المريض الخضوع لاختبار فيروس نقص المناعة البشرية tropism للتأكد من أن له أو لها السكان الفيروسية يستخدم coreceptor CCR5 لدخول الخليوي ، وليس coreceptor البديلة. نهج واحد لاختبار tropism هو دراسة تسلسل المنطقة V3 من المغلف فيروس نقص المناعة البشرية ، والتي تتفاعل مع coreceptor.
يتم استخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي من بلازما الدم : الأساليب. يتم تضخيمه في المنطقة V3 في ثلاث نسخ مع متداخلة عكس المنتسخة – PCR. والتسلسل ثم التكبير وتحليلها باستخدام البرنامج ، RE_Call. ثم تقدم متواليات لخوارزمية بيوينفورمتيك مثل geno2pheno لاستنتاج tropism الفيروسية من المنطقة V3. ويستدل على أن يكون تسلسل غير R5 إذا بهم geno2pheno معدل ايجابية كاذبة ينخفض 5.75 ٪. إذا تم الاستدلال على أي واحد من ثلاثة من متواليات عينة غير قابلة للR5 ، والمريض من غير المرجح أن يستجيب لCCR5 – المتناحرين.
الطريقة المعروضة هنا هي طريقة التسلسل القياسية المطبقة على اختبار tropism. التطبيق السريري لفيروس نقص المناعة البشرية المغلف حلقة V3 تسلسل للتنبؤ tropism الفيروسية وحتى وقت متأخر كان محدودا. وقد تبين أن هذا الأسلوب ، في تحليلات بأثر رجعي للمحاكمات (فييف الرعاية الصحية) maraviroc السريرية ، لتكون قادرة على قدم المساواة في الحد الأدنى للتنبؤ الفيروسي في tropism بالمقارنة مع غيرها من فحوصات التحقق من صحة استخدامها سريريا.
هناك العديد من الفوائد لأداء تحليل الوراثي من الحلقة V3 للتنبؤ tropism. أولا وأخيرا ، يمكن تنفيذ هذا الإجراء في أي منشأة بمعدات تسلسل العمليات ، زيادة كبيرة في الوصول وتقليل الفترة الزمنية اللازمة لاختبار tropism. في المقارنة ، يتم تنفيذ المظهري Trofile الحساسية الفحص المعزز (ESTA) (حرف واحد فقط العلوم البيولوجية) ، والتي كانت بمثابة معيار الذهب لاختبار tropism ، في مركز واحد في جنوب كاليفورنيا. مزايا إضافية تشمل متطلبات أقل من المواد ابتداء والحد الأدنى المطلوب تحميل البلازما الفيروسية 500copies/mL. كذلك ، فإن التكاليف التشغيلية لتشغيل الفحص الوراثي منخفضة نسبيا بالمقارنة مع تلك التي لفحص المظهري. استخدام البرمجيات نتذكر بشكل خاص يلغي الحاجة إلى استعراض التسلسل اليدوي ، الذي يميل إلى أن يكون جزءا من العمل المكثف يحلل التركيب الوراثي.
الطريقة المعروضة هنا واضحة إلى حد ما ، مع عدم وجود خطوة معينة أخرى تفوق في أهميتها. نحن لا نقترح تشغيل PCR والتسلسل في ثلاث نسخ لزيادة احتمالات الأنواع التقاط أقلية بين السكان الفيروسية لعينة. لا يمكن أن يؤديها يعيد أكبر من ثلاثة ، إلا أننا وجدنا أن كلا triplicates كفاءة وموثوق بها. علينا أيضا أن توحي باستخدام خطوة واحدة عكس المنتسخة PCR كيت (Qiagen) الذي ينفذ على حد سواء RT – PCR PCR وأول جولة في نفس رد الفعل مع الحفاظ على خصوصية وحساسية عالية.
The authors have nothing to disclose.
وأيد تطوير هذا الفحص من خلال الرعاية الصحية فييف والمعاهد الكندية للأبحاث الصحية (CIHR) ومن خلال رئيس شركة جلاكسو سميث كلاين / CIHR في علم الفيروسات السريرية لهاريجان د.
الدعم المقدم من قبل شركة فايزر والرعاية الصحية فييف.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
RNA extraction using NucliSens easyMAG version 1.0 | ||||
NucliSens easyMAG Magnetic Silica | bioMerieux | cat. # 280133 | (48 x 0.6 ml) | |
NucliSens easyMAG Lysis Buffer | bioMerieux | cat. # 280134 | (4 x 1000 ml) | |
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 1 | bioMerieux | cat. # 280130 | (4 x 1000 ml) | |
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 2 | bioMerieux | cat. # 280131 | (4 x 1000 ml) | |
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 3 | bioMerieux | cat. # 280132 | (4 x 1000 ml) | |
NucliSens easyMAG version 1.0 | bioMerieux | |||
Class II A2 biological safety cabinet | ||||
One-Step Reverse Transcriptase PCR and Second Round PCR | ||||
DEPC-treated water | Ambion Corp. | cat. # 9922 | ||
SuperScrip III One-Step RT-PCR System with Platinum Taq High Fidelty | Invitrogen | cat#12574-035 | Kit components used: – SuperScript III RT/ Platinum Taq High Fidelty Enzyme Mix – 2X Reaction Mix (a buffer containing 0.4mM of each dNTP, 2.4mM MgSO4) |
|
Expand High Fidelity PCR System | Roche Diagnostics | cat. # 1 759 078 | Kit components used: – Expand High Fidelity Buffer 10X conc. with 15 mM MgCl2 (lids labelled 2) – Expand HF PCR Enzyme Mix (3.5U/μl) – MgCl2 Stock Solution (25mM) (lids labelled 4) |
|
dNTPs: dATP, dGTP, dCTP, dTTP | Roche Diagnostics | cat. # 11969064001 | (100 mM) | |
Sucrose | Sigma | cat. # S0389-500G | ||
Bromophenol blue sodium salt | Sigma | cat.# B5525 | ||
Cresol Red | Sigma | cat.# 114472-5G | indicator grade | |
Thermocycler | ||||
Gel Electrophoresis | ||||
50X TAE buffer | Invitrogen | cat. # 24710030 | (1000 ml) | |
SYBR Safe DNA gel stain | Invitrogen Life Technologies | cat. # S33102 | ||
Agarose (ultra pure) | Invitrogen | cat. # 15510-027 | ||
E-Gel Low Range Quantitative DNA Ladder | Invitrogen Life Technologies | cat. # 12373-031 | ||
Reagent Grade Type II water | ||||
Gel apparatus | ||||
Sequencing | ||||
ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit | Applied Biosciences | cat. # 4337458 | (25000 reactions) | |
Hi-Di Formamide | Applied Biosciences | cat. # 4311320 | ||
Sodium Acetate (NaOAc) | Sigma | cat. # S-2889 | ||
EDTA | Sigma-Aldrich | Cat.# 03690-100ML | 0.5M, pH=8.0 | |
TRIZMA Hydrochloride Buffer Solution | Sigma | cat. # T-2819 | 1 M, pH 9.0 | |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma | cat. # M-1028 | 1 M | |
95% Ethanol | ||||
Running Buffer (10X) with EDTA | Applied Biosystems | cat. # 4335613 | 500 mL | |
Polymer Pop-7 (25mL) Or Polymer Pop-7 (10mL) | Applied Biosystems | cat. # 44363929 or cat. # 4352759 | ||
3700/3730 BigDye Terminator v3.1 Sequencing Standard Kit | Applied Biosciences | Cat# 4336943 | ||
Thermocycler | ||||
Centrifuge with plate holders | ||||
3730xl DNA Analyzer | Applied Biosciences |