Composição de extratos de lipídios polares e da composição de ácidos graxos de glycerolipids individuais são determinados em um experimento simples e robusto perfil lipídico. Para este fim, glycerolipids são isolados por cromatografia em camada delgada e submetido a transmetilação de seus grupos acil. Graxos methylesters acila são quantificados por cromatografia gás-líquido.
Biológica células membranas separado do ambiente. A partir de uma única célula de plantas e animais multicelulares, glycerolipids, como fosfatidilcolina ou fosfatidiletanolamina, membranas formam bicamada que atuam tanto como os limites e interfaces para permuta química entre as células e seus arredores. Ao contrário dos animais, células vegetais têm uma organela especial para a fotossíntese, o cloroplasto. O sistema de membrana intrincados do cloroplasto contém glycerolipids única, ou seja, glicolipídeos falta de fósforo: monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) 4. Os papéis destes lipídios são além de simplesmente estrutural. Estes glicolipídeos e glycerolipids outros foram encontrados na estrutura cristalina do fotossistema I e II, que indica o envolvimento de glycerolipids na fotossíntese 8,11. Durante a fome de fosfato, DGDG é transferido para membranas extraplastidic para compensar a perda de fosfolipídeos 9,12.
Muito do nosso conhecimento da biossíntese e função desses lipídios foi derivado de uma combinação de estudos genéticos e bioquímicos com 14 Arabidopsis thaliana. Durante esses estudos, um procedimento simples para a análise de lipídios polares tem sido essencial para o rastreamento e análise de mutantes lipídico e será descrito em detalhes. Um extrato de lipídios folha é primeiro separados por cromatografia em camada delgada (TLC) e glycerolipids estão manchadas reversivelmente com vapor de iodo. Os lipídios individuais são raspadas da placa de TLC e convertidos em gordura methylesters acila (FAMEs), que são analisados por cromatografia gás-líquido acoplado com detecção de ionização de chama (FID-GLC) (Figura 1). Este método tem provado ser uma ferramenta confiável para a seleção de mutantes. Por exemplo, o tgd1, 2,3,4 retículo endoplasmático-to-plastid mutantes tráfico de lipídios foram descobertos com base na acumulação de um galactoglycerolipid anormal: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) e uma diminuição na quantidade relativa de 18:03 (carbonos: double títulos) grupos acila graxos em lipídios de membrana 3,13,18,20. Este método também é aplicável para a determinação atividades enzimáticas de proteínas usando lipídios como substrato 6.
TLC juntamente com GLC fornece uma ferramenta robusta e rápida de análise quantitativa de lipídios polares em plantas. Pequenas mudanças na composição lipídica podem ser identificados e, portanto, este método tem sido utilizado para triagem em larga escala de mutantes deficientes nas vias metabólicas lipídicas polar 1,20. Este método também é amplamente utilizado para atividades de monitoramento de enzimas utilizando lipídeos polares como substrato. 2,6,7
Além de folhas, a composição lipídica de outros tecidos vegetais, como raízes e sementes ou frações subcelulares, como cloroplastos e mitocôndria também pode ser determinado da mesma maneira.
O sistema de solvente (acetona, tolueno, água) aqui utilizado é otimizado para a separação de glicolipídios e fosfolipídios em plantas. No entanto, em tgd1, 2,3,4 mutantes e cloroplastos isolados, TGDG executado em conjunto com o PE, enquanto tetragalactosyldiacylglycerol funciona com PC. Neste caso, um sistema de solventes com clorofórmio, metanol, ácido acético e água (85: 20: 10: 4, v / v / v / v) é usado 13. Às vezes bidimensional TLC usando dois diferentes sistemas solventes é realizada para mais glycolipids separado e fosfolipídios 19. Além disso, tecidos vegetais podem ser diretamente submetidas à reação FAME seguido por GLC para determinar o perfil de ácidos graxos totais, sem separação inicial sobre TLC 5. Ao lado do TLC-GLC demonstrado sistema, outro método utilizado para o perfil lipídico é baseado em directo de massas com ionização electrospray em tandem espectrometria de 17. Neste método, a separação cromatográfica inicial de lipídios no extrato é omitido. No entanto, este método requer equipamentos caros e pessoal experiente, o que o torna menos útil para análises de rotina no laboratório ou para a seleção de mutantes.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho é apoiado por uma bolsa da National Science Foundation EUA para Christoph Benning.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
α-naphthol | Sigma-Aldrich | N1000 | ||
Methanolic HCL 3N | Sigma-Aldrich | 33050-U | Dilute to 1N by methanol | |
Si250-PA TLC plates | J.T.Baker | 7003-04 | With pre-absorbent | |
TLC chamber | Sigma-Aldrich | Z266000 | ||
Screw cap tubes | VWR | 53283-800 | ||
Scew caps | Sun Sri | 13-425 | ||
PTFE disk | Sun Sri | 200 608 | ||
GLC system | Hewlett Packard | HP6890 | ||
DB-23 column | J&W Scientific | 122-2332 | ||
GLC vials | Sun Sri | 500 132 | ||
Caps of GLC vials | Sun Sri | 201 828 | ||
Chemstation software | Agilent | G2070AA |