Composition des extraits lipidiques polaires et la composition en acides gras de glycérolipides individuels sont déterminés dans une expérience de profilage des lipides simples et robustes. À cette fin, glycérolipides sont isolés par chromatographie sur couche mince et soumis à transméthylation de leurs groupes acyle. Fatty acyl esters méthyliques sont quantifiés par chromatographie gaz-liquide.
Biologique des cellules des membranes distincte de l'environnement. D'une cellule unique pour les plantes et les animaux multicellulaires, glycérolipides, tels que la phosphatidylcholine ou la phosphatidyléthanolamine, membranes bicouches forme qui agissent à la fois comme des limites et des interfaces pour l'échange chimique entre les cellules et leur environnement. Contrairement aux animaux, les cellules végétales ont un organite spéciale pour la photosynthèse, les chloroplastes. Le système de membrane du chloroplaste complexes glycérolipides contient uniques, à savoir glycolipides manque de phosphore: monogalactosyldiacylglycérol (MGDG), digalactosyldiacylglycérol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) 4. Les rôles de ces lipides sont tout simplement au-delà des structures. Ces glycolipides et glycérolipides autres ont été trouvés dans les structures cristallines du photosystème I et II indiquant l'implication de glycérolipides dans la photosynthèse 8,11. Pendant la famine de phosphate, DGDG est transféré sur des membranes extraplastidic pour compenser la perte de phospholipides 9,12.
Une grande partie de notre connaissance de la biosynthèse et la fonction de ces lipides a été dérivé d'une combinaison d'études génétiques et biochimiques de 14 Arabidopsis thaliana. Durant ces études, une procédure simple pour l'analyse des lipides polaires a été essentiel pour le dépistage et l'analyse des lipides et des mutants seront décrites en détail. Un extrait lipidique des feuilles est d'abord séparés par chromatographie sur couche mince (CCM) et glycérolipides sont colorées de manière réversible avec la vapeur d'iode. Les lipides individuels sont grattées de la plaque de CCM et convertis en esters méthyliques gras acyle (FAME), qui sont analysés par chromatographie en phase gazeuse couplée à un détecteur à ionisation de flamme (FID-GLC) (figure 1). Cette méthode a été prouvée pour être un outil fiable pour le dépistage du mutant. Par exemple, le tgd1, 2,3,4 réticulum endoplasmique-à-plastes mutants trafic de lipides ont été découvertes basées sur l'accumulation d'une galactoglycerolipid anormale: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) et une diminution de la quantité relative de 18h03 (carbones: double obligations) groupes acyle gras dans les lipides de la membrane 3,13,18,20. Cette méthode est également applicable pour la détermination des activités enzymatiques de protéines en utilisant des lipides comme substrat 6.
TLC couplé avec CGL offre un outil robuste et rapide pour l'analyse quantitative des lipides polaires dans les plantes. De petits changements dans la composition lipidique peut être identifié, par conséquent, cette méthode a été utilisée pour le dépistage à grande échelle des mutants déficients dans les régions polaires des voies métaboliques des lipides 1,20. Cette méthode est également largement utilisé pour les activités de surveillance des enzymes utilisant des lipides polaires comme substrat. 2,6,7
Outre les feuilles, la composition lipidique des autres tissus végétaux comme les racines et les graines ou les fractions subcellulaires comme les chloroplastes et les mitochondries peuvent également être déterminés de la même manière.
Le système de solvants (acétone, toluène, eau) utilisé ici est optimisé pour la séparation des glycolipides et des phospholipides dans les plantes. Cependant, dans tgd1, 2,3,4 mutants et les chloroplastes isolés, TGDG s'exécute avec PE tandis tetragalactosyldiacylglycerol fonctionne avec un PC. Dans ce cas, un système de solvant avec du chloroforme, le méthanol, l'acide acétique et de l'eau (85: 20: 10: 4, v / v / v / v) est utilisé 13. Parfois deux dimensions TLC en utilisant deux différents systèmes de solvants est effectué pour d'autres glycolipides et des phospholipides séparés 19. En outre, les tissus de la plante peuvent être directement soumis à la réaction suivie par GLC FAME pour déterminer le profil des acides gras totaux sans séparation initiale sur TLC 5. A côté de la CCM ont démontré GLC-système, une autre méthode utilisée pour le profilage des lipides est basé sur la masse d'ionisation électrospray directe tandem de spectrométrie 17. Dans cette méthode, la séparation chromatographique initiale de lipides dans l'extrait est omise. Cependant, cette méthode nécessite un équipement coûteux et un personnel expérimenté, ce qui rend moins utile pour des analyses de routine en laboratoire ou pour le dépistage mutant.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail est soutenu par une subvention du US National Science Foundation à Christoph Benning.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
α-naphthol | Sigma-Aldrich | N1000 | ||
Methanolic HCL 3N | Sigma-Aldrich | 33050-U | Dilute to 1N by methanol | |
Si250-PA TLC plates | J.T.Baker | 7003-04 | With pre-absorbent | |
TLC chamber | Sigma-Aldrich | Z266000 | ||
Screw cap tubes | VWR | 53283-800 | ||
Scew caps | Sun Sri | 13-425 | ||
PTFE disk | Sun Sri | 200 608 | ||
GLC system | Hewlett Packard | HP6890 | ||
DB-23 column | J&W Scientific | 122-2332 | ||
GLC vials | Sun Sri | 500 132 | ||
Caps of GLC vials | Sun Sri | 201 828 | ||
Chemstation software | Agilent | G2070AA |