Samenstelling van de polaire lipiden extracten en de vetzuursamenstelling van de individuele glycerolipids worden bepaald in een eenvoudige en robuuste lipide profilering experiment. Voor dit doel worden glycerolipids geïsoleerd door dunnelaagchromatografie en onderworpen aan transmethylation van hun acylgroepen. Fatty acyl methylesters worden gekwantificeerd door middel van gas-vloeistofchromatografie.
Biologische membranen afzonderlijke cellen uit de omgeving. Van een enkele cel tot meercellige planten en dieren, glycerolipids, zoals fosfatidylcholine of fosfatidylethanolamine, vorm dubbellaag membranen die fungeren als zowel de grenzen en de interfaces voor chemische uitwisseling tussen cellen en hun omgeving. In tegenstelling tot dieren, plantencellen hebben een speciale organel voor fotosynthese, de chloroplast. Het ingewikkelde membraan systeem van de chloroplast bevat unieke glycerolipids, namelijk glycolipiden gebrek aan fosfor: monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) 4. De rollen van deze lipiden zijn dan alleen structureel. Deze glycolipiden en andere glycerolipids werden gevonden in de kristalstructuren van fotosysteem I en II met de betrokkenheid van de glycerolipids in de fotosynthese 8,11. Tijdens het fosfaat verhongering, is DGDG overgebracht naar extraplastidic membranen om het verlies van fosfolipiden 9,12 compenseren.
Veel van onze kennis van de biosynthese en de functie van deze lipiden is afgeleid van een combinatie van genetische en biochemische studies met Arabidopsis thaliana 14. Tijdens deze studies heeft een eenvoudige procedure voor de analyse van polaire lipiden essentieel geweest voor de screening en analyse van de lipiden mutanten en wordt in detail beschreven. Een blad lipide extract wordt eerst van elkaar gescheiden door dunne laag chromatografie (TLC) en glycerolipids zijn reversibel gekleurd met jodium dampen. De individuele lipiden zijn geschraapt van de TLC-plaat en omgezet in vet acyl methylesters (Fames), die worden geanalyseerd door gas-vloeistofchromatografie gekoppeld met een vlam ionisatie detectie (FID-GLC) (Figuur 1). Deze methode is bewezen dat een betrouwbaar instrument voor de mutant screening worden. Bijvoorbeeld, de tgd1, 2,3,4 endoplasmatisch reticulum-to-plastide lipide mensenhandel mutanten werden ontdekt op basis van de accumulatie van een abnormale galactoglycerolipid: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) en een daling van de relatieve hoeveelheid van 18:3 (kool: dubbel obligaties) vet acylgroepen in membraanlipiden 3,13,18,20. Deze methode is ook van toepassing voor het bepalen van enzymatische activiteiten van eiwitten met behulp van lipiden als substraat 6.
DLC gekoppeld met GLC biedt een robuuste en snelle tool voor kwantitatieve analyse van polaire lipiden in planten. Kleine veranderingen in lipide samenstelling kan worden geïdentificeerd, daarom is deze methode is gebruikt voor grootschalige screening van mutanten een verminderde in polaire lipiden metabole routes 1,20. Deze methode wordt ook veel gebruikt voor de monitoring-activiteiten van enzymen gebruik te maken van polaire lipiden als substraat. 2,6,7
Behalve bladeren, kan de lipide samenstelling van andere plantaardige weefsels, zoals wortels en zaden of subcellulaire fracties, zoals chloroplasten en mitochondria ook worden bepaald op dezelfde manier.
Het oplosmiddel-systeem (aceton, tolueen, water) hier gebruikt is geoptimaliseerd voor de scheiding van glycolipiden en fosfolipiden in planten. Echter, in tgd1, 2,3,4 mutanten en geïsoleerde chloroplasten, TGDG loopt samen met PE, terwijl tetragalactosyldiacylglycerol draait met PC. In dit geval is een oplosmiddel systeem met chloroform, methanol, azijnzuur en water (85: 20: 10: 4, v / v / v / v) wordt gebruikt 13. Soms twee-dimensionale DLC met twee verschillende oplosmiddelen systemen wordt uitgevoerd om verder te scheiden glycolipiden en fosfolipiden 19. Bovendien kunnen plantenweefsels direct worden onderworpen aan de FAME-reactie, gevolgd door GLC de totale vetzuurprofiel vast te stellen zonder eerste scheiding op TLC 5. Naast de aangetoonde TLC-GLC-systeem, is een andere methode gebruikt voor het lipide profilering op basis van directe electrospray ionisatie tandem massaspectrometrie 17. In deze methode wordt de eerste chromatografische scheiding van lipiden in het extract is weggelaten. Echter, deze methode vereist dure apparatuur en ervaren personeel, waardoor het minder nuttig voor routine-analyses in het laboratorium of voor mutant screening.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk wordt ondersteund door een subsidie van de Amerikaanse National Science Foundation om Christoph Benning.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
α-naphthol | Sigma-Aldrich | N1000 | ||
Methanolic HCL 3N | Sigma-Aldrich | 33050-U | Dilute to 1N by methanol | |
Si250-PA TLC plates | J.T.Baker | 7003-04 | With pre-absorbent | |
TLC chamber | Sigma-Aldrich | Z266000 | ||
Screw cap tubes | VWR | 53283-800 | ||
Scew caps | Sun Sri | 13-425 | ||
PTFE disk | Sun Sri | 200 608 | ||
GLC system | Hewlett Packard | HP6890 | ||
DB-23 column | J&W Scientific | 122-2332 | ||
GLC vials | Sun Sri | 500 132 | ||
Caps of GLC vials | Sun Sri | 201 828 | ||
Chemstation software | Agilent | G2070AA |