Summary

異種細胞での化学感覚受容体の表面発現をアッセイ

Published: February 23, 2011
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Summary

ここでは、便利なHEK293T細胞の表面上の嗅覚受容体を検出するために使用することができる生細胞の染色を実施するためのプロトコルを示しています。さらに、それはまた他の化学感覚受容体やGPCRの表面発現のためのアッセイに使用することができます。

Abstract

悪臭の鮮やかな世界は、嗅覚の感覚によって認識されています。マウスでの嗅覚は、Gタンパク質Gαolfと結合することによって揮発性の匂い分子を結合し、細胞内の信号に細胞外シグナルに変換するために仮定されている約1200のGタンパク質共役受容体(GPCR)1のレパートリーによって媒介される。受容体への臭気物質の結合を組み合わせルールに従うと考えられている、つまり、1つの嗅覚は、いくつかの受容体に結合する可能性があり、つの受容体は、程度の差は2に、複数の匂い物質を結合することができる。生化学、シグナリングおよびリガンド結合研究は、便利な異種細胞を使用するほとんどのGPCRのために行われている。トランスフェクションに彼らは表面にエクスポートに失敗したので、しかし、嗅覚受容体の研究のために異種細胞の使用は長い間排除されました。齋藤らは、家族のシャペロンを共が一緒に3をトランスフェクトされた異種細胞の表面へのトラフィックの嗅覚受容体へのシャペロンとしての嗅覚ニューロンと行為で強化された発現を示すタンパク質を輸送する単一の細胞膜の通過の受容体(RTP)を示している。受容体は細胞株における堅牢な表面発現を示す場合に異種細胞を使用し受容するための生化学的アッセイを行うには、最初に決定する必要があります。これは、生細胞の染色に続いてシャペロンのRTP1Sと受容体は、蛍光細胞外ドメインまたは排他的に細胞外ドメイン内のタグにラベルを付けるために過剰発現によってアッセイすることができます。ここでは、便利なHEK293T細胞の表面上の嗅覚受容体を検出するために使用することができる生細胞の染色を実施するためのプロトコルを示しています。さらに、それはまた他の化学感覚受容体やGPCRの表面発現のためのアッセイに使用することができます。

Protocol

1。手順: 転送細胞、トランスフェクションおよび免疫細胞化学、日ごとに行わつのステップ:プロシージャでは、3日間の合計時間をかけて完成した三つの部分から構成されています。最初の二日間での転送と細胞のトランスフェクションは、層流室内の無菌状態で実施する必要があります。 1日目:表面発現アッセイのためのHEK293T細胞の譲渡。 <ol…

Discussion

各ステップは、著名な、独特の表面の汚れを確実にするために慎重に実施しなければならない。全体の染色工程は、(氷上で)寒さで実施しなければならない、とカバースリップが配置されているトレイは、細胞が生き続けることを確認するために使用する前に冷却する必要があります。また固定は表面染色のプロセスの最後に実行されます。これは固定では一次および二次抗体に細胞膜を?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我々は、この原稿の重要な読書のために松浪研究室のメンバーに感謝。

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Cover slip 22 X 22 mm (#1)   Thermo Scientific 72200-11  
Fetal bovine serum   Gibco 16000  
Lipofectamine 2000   Invitrogen 11668-019  
Minimal essential medium   Sigma M4655 With L glutamate, Earle’s salt and bicarbonate
Mowiol   Calbiochem 475904  
Paraformaldehyde   EMS 19208  
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 1X   Gibco 14025 With calcium chloride and magnesium chloride
HEPES Buffer Solution   Gibco 15630  
Phosphate Buffer Saline (PBS)   Cellgro 21-040-CV Without calcium and magnesium
Poly D Lysine Hydrobromide   Sigma P7280  
Sodium Azide   EM Science SX0299-1  
Tissue culture dish 35 X 10 mm   Falcon 353801  
Trypsin-EDTA   Gibco 25300 0.05%

References

  1. Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, 175-187 (1991).
  2. Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, 713-723 (1999).
  3. Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119, 679-691 (2004).
  4. Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).

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Cite This Article
Dey, S., Zhan, S., Matsunami, H. Assaying Surface Expression of Chemosensory Receptors in Heterologous Cells. J. Vis. Exp. (48), e2405, doi:10.3791/2405 (2011).

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