Summary

Assaying הביטוי Surface של קולטנים Chemosensory בתוך תאים Heterologous

Published: February 23, 2011
doi:

Summary

כאן אנו להדגים פרוטוקול לבצע מכתים תא חי, שניתן להשתמש בהם כדי לזהות קולטנים odorant על פני השטח של תאים HEK293T בנוחות. בנוסף, הוא עשוי לשמש גם כדי assay לביטוי פני השטח של קולטנים chemosensory אחרים או GPCRs.

Abstract

עולם החי של ריחות מוכר על ידי תחושת olfaction. Olfaction בעכברים מתווך על ידי רפרטואר של כ 1200 רצפטורים G חלבון יחד (GPCRs) 1, כי הם הניחו לקשור מולקולות odorant נדיפים המרת אותות תאיים לתוך האות תאיים על ידי צימוד עם חלבון G Gαolf. עקידת odorants אל קולטנים הוא חשב ללכת כלל קומבינטורית, כלומר, אחד odorant עלולים להיקשר לקולטנים מספר אחד יכול להיקשר לקולטן odorants מספר בדרגות 2. אותות ביוכימיים, ומחקרים מחייב ליגנד בוצעו בנוחות החוצה GPCRs ביותר באמצעות תאים Heterologous. אולם השימוש בתאי Heterologous למחקר של קולטנים odorant, היתה מנועה במשך זמן רב מאז על transfection הצליחו לייצא אל פני השטח. סאיטו et al הראו קרום יחיד לעבור הובלת חלבון קולטן (RTP) מלווים המשפחה להראות ביטוי משופרת הנוירונים חושי הריח ולפעול מלווים כדי odorant קולטני תנועה על פני השטח בתאים Heterologous, כאשר שיתוף transfected יחד 3. כדי לבצע את מבחני ביוכימיים עבור הקולטנים באמצעות תאים Heterologous, יש לקבוע תחילה אם הקולטן מראה ביטוי משטח יציב בקו התא. זה יכול להיות assayed ידי overexpressing את הקולטנים עם RTP1S המלווה ואחריו תא חי מכתים את fluorescently התווית תחום תאי או תג בתחום תאיים בלבד. כאן אנו להדגים פרוטוקול לבצע מכתים תא חי, שניתן להשתמש בהם כדי לזהות קולטנים odorant על פני השטח של תאים HEK293T בנוחות. בנוסף, הוא עשוי לשמש גם כדי assay לביטוי פני השטח של קולטנים chemosensory אחרים או GPCRs.

Protocol

1. נוהל: ההליך מורכב משלושה חלקים הושלמה לאורך זמן כולל של 3 ימים: העברת תאים, transfection ו immunocytochemistry, צעד אחד ביצע ליום. העברת transfection של תאים במהלך היומיים הראשונים חייב להתבצע בתנאים סטריליים בחדר זרימה למינרית. <p class="jove_step" style=";text-alig…

Discussion

כל צעד חייב להתבצע בקפידה כדי להבטיח מכתים משטח בולט וייחודי. התהליך מכתים כולו צריך להתבצע קר (על הקרח), וכן את המגש על אשר מחליק לכסות מוטלות חייב להיות מקורר לפני השימוש כדי להבטיח תאים להישאר בחיים. יתר על כן קיבוע נעשה בסוף התהליך מכתים פני השטח. זהו ניגוד חריף עם צ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לחברי Matsunami מעבדה קריאה ביקורתית של כתב היד הזה.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Cover slip 22 X 22 mm (#1)   Thermo Scientific 72200-11  
Fetal bovine serum   Gibco 16000  
Lipofectamine 2000   Invitrogen 11668-019  
Minimal essential medium   Sigma M4655 With L glutamate, Earle’s salt and bicarbonate
Mowiol   Calbiochem 475904  
Paraformaldehyde   EMS 19208  
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 1X   Gibco 14025 With calcium chloride and magnesium chloride
HEPES Buffer Solution   Gibco 15630  
Phosphate Buffer Saline (PBS)   Cellgro 21-040-CV Without calcium and magnesium
Poly D Lysine Hydrobromide   Sigma P7280  
Sodium Azide   EM Science SX0299-1  
Tissue culture dish 35 X 10 mm   Falcon 353801  
Trypsin-EDTA   Gibco 25300 0.05%

References

  1. Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, 175-187 (1991).
  2. Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, 713-723 (1999).
  3. Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119, 679-691 (2004).
  4. Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).

Play Video

Cite This Article
Dey, S., Zhan, S., Matsunami, H. Assaying Surface Expression of Chemosensory Receptors in Heterologous Cells. J. Vis. Exp. (48), e2405, doi:10.3791/2405 (2011).

View Video