Summary

Экс естественных Расширение опухоли-реактивных Т-клеток посредством систем бриостатин 1/Ionomycin и общие гамма Сеть Цитокины Разработка

Published: January 14, 2011
doi:

Summary

Эффективный протокол для<em> Исключая виво</em> Расширение опухоли реактивных Т-клеток из опухоли дренаж лимфатических узлов или других вторичных лимфоидных тканей с опухолями хостов описано. Этот протокол расширяет выборочно опухолеспецифические Т-клеток для использования в приемных иммунотерапии рака молочной железы.

Abstract

Как сообщалось, больных раком молочной железы у уже существующих иммунного ответа против 1,2 опухолей. Однако такие иммунные реакции не обеспечивают полную защиту от развития или рецидива рака молочной железы. Чтобы преодолеть эту проблему путем увеличения частоты опухолевых-реактивных Т-клеток, усыновителей иммунотерапии был принят на работу. Различные протоколы были использованы для расширения опухолеспецифические Т-клеток. Эти протоколы, однако, ограничивается использование опухоли естественных бывший антигенов для активации антиген-специфических Т-клеток. Совсем недавно, общая гамма цепи цитокинов, таких как IL-2, ИЛ-7, Ил-15 и Ил-21 были использованы отдельно или в комбинации для повышения противоопухолевого иммунного ответа 3. Тем не менее, не ясно, что формулировка будет работать лучше всего на расширение опухоли реактивных Т-клеток. Здесь мы приводим протокол для селективной активации и расширению опухоли реактивных Т-клеток от FVBN202 трансгенной мышиной модели HER-2/neu положительным раком молочной железы для использования в приемных Т-клеточной терапии рака молочной железы. Протокол включает в себя активацию Т-клеток с bryostatin-1/ionomycin (B / I) и ИЛ-2 при отсутствии опухолевых антигенов в течение 16 часов. B / I имитирует активации внутриклеточных сигналов, которые приводят к активации Т-клеток за счет увеличения протеинкиназы С активности и внутриклеточного кальция, соответственно, 4. Этот протокол специально активирует опухоль-специфический Т-клеток, убивая не имеет значения Т-клеток. B / I активированных Т-клетки культивировали с IL-7 и ИЛ-15 в течение 24 часов, а затем импульсным ИЛ-2. После 24 часов, Т-клетки промывают, раскол, и культивируют с IL-7 + ИЛ-15 для 4 дополнительных дней. Опухоль-специфичность и противоопухолевой эффективности исключая виво расширил Т-клеток определяется.

Protocol

1. Выделение лимфоцитов 5 Изолировать опухоли дренаж лимфатических узлов или селезенки с опухолями FVBN202 трансгенных мышей и подготовить суспензии отдельных клеток в ледяной RPMI1640 с добавлением 10% FBS. B / I активации в 50-мл полипропиленовые трубы конической результаты в большей …

Discussion

Селективный расширение опухоли-реактивный Т-клеток с эффекторной противоопухолевой функция может быть достигнуто за счет предлагаемого протокола использованием B / I активации и экс расширения естественных условиях с гамма цепи цитокинов IL-2, ИЛ-7 и ИЛ-15. Хотя ИЛ-2 Т фактор рост…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана NIH R01 CA104757 Грант (MH Manjili). Мы выражаем искреннюю благодарность поддержке VCU Massey онкологический центр и Фонд Содружества по исследованию рака.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Bryostatin 1   Sigma B7431-10ug  
Ionomycin   Calbiochem 407950  
Mouse IL-7   PeproTech 217-17  
Mouse IL-15   PeproTech 210-15  
Human IL-2   PeproTech 200-02  
RPMI1640   Invitrogen 11875  
FBS   Gemini 100-106  
Penicillin/Streptomycin   Cellgro 30-002-CI  
L- glutamine   Invitrogen 25030081  
β- mercaptoethanol   Sigma M7522  
anti-CD16/32 antibody   Biolegend 101302  
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit   BD Pharmingen 556547  
FITC-CD4   Biolegend 100406  
PE-CD8   Biolegend 100708  
anti-c-Erb2/c–Neu   Calbiochem OP16  
PE- anti mouse IgG   Biolegend 405307  
formaldehyde   Polysciences 04018  
Hemocytometer   Hycor 87144  
Light microscope   VWR V200073  
Mouse IFN-γ ELISA set   BD Pharmingen 555138  
Cell culture flasks   Greiner 658175  

References

  1. Goodell, V., Waisman, J., Salazar, L. G., de la Rosa, C., Link, J., Coveler, A. L., Childs, J. S., Fintak, P. A., Higgins, D. M., Disis, M. L. Level of HER-2/neu protein expression in breast cancer may affect the development of endogenous HER-2/neu-specific immunity. Mol Cancer Ther. 7, 449-454 (2008).
  2. Disis, M. L., Knutson, K. L., Schiffman, K., Rinn, K., McNeel, D. G. Pre-existent immunity to the HER-2/neu oncogenic protein in patients with HER-2/neu overexpressing breast and ovarian cancer. Breast Cancer Res Treat. 62, 245-252 (2000).
  3. Liu, S., Riley, J., Rosenberg, S., Parkhurst, M. Comparison of common gamma-chain cytokines, interleukin-2, interleukin-7, and interleukin-15 for the in vitro generation of human tumor-reactive T lymphocytes for adoptive cell transfer therapy. J. Immunother. 29, 284-293 (2006).
  4. Bear, H. D., Roberts, J., Cornell, D., Tombes, M. B., Kyle, B. Adoptive immunotherapy of cancer with pharmacologically activated lymph node lymphocytes: a pilot clinical trial. Cancer Immunol Immunother. 5, 269-274 (2001).
  5. Morales, J. K., Kmieciak, M., Graham, L., Feldmesser, M., Bear, H. D., Manjili, M. H. Adoptive transfer of HER2/neu-specific T cells expanded with alternating gamma chain cytokines mediate tumor regression when combined with the depletion of myeloid-derived suppressor cells. Cancer Immunol Immunother. 58, 941-953 (2009).
  6. Cha, E., Graham, L., Manjili, M. H., Bear, H. D., Guy, C. T., Webster, M. A., Schaller, M., Parsons, T. J., Cardiff, R. D. IL-7 + IL-15 are superior to IL-2 for the ex vivo expansion of 4T1 mammary carcinoma-specific T cells with greater efficacy against tumors in vivo. Breast Cancer Res Treat. 89, 10578-10582 (2009).
  7. Kmieciak, M., Morales, J. K., Morales, J., Bolesta, E., Grimes, M., Manjili, M. H. Danger signals and nonself entity of tumor antigen are both required for eliciting effective immune responses against HER-2/neu positive mammary carcinoma: implications for vaccine design. Cancer Immunol Immunother. 57, 1391-1398 (2008).
  8. Stern, J. B., Smith, K. A. Interleukin-2 induction of T-cell G1 progression and c-myb expression. Science. 233, 203-206 (1986).
  9. Kittipatarin, C., Khaled, A. R. ex vivo expansion of memory CD8 T cells from lymph nodes or spleen through in vitro culture with interleukin-7. J Immunol Methods. 344, 45-57 (2009).
  10. Kokaji, A. I., Hockley, D. L., Kane, K. P. IL-15 transpresentation augments CD8+ T cell activation and is required for optimal recall responses by central memory CD8+ T cells. J Immunol. 180, 4391-4401 (2008).
  11. Le, H. K., Graham, L., Miller, C. H., Kmieciak, M., Manjili, M. H., Bear, H. D. Incubation of antigen-sensitized T lymphocytes activated with bryostatin 1 + ionomycin in IL-7 + IL-15 increases yield of cells capable of inducing regression of melanoma metastases compared to culture in IL-2. Cancer Immunol Immunother. 58, 1565-1576 (2009).

Play Video

Cite This Article
Kmieciak, M., Toor, A., Graham, L., Bear, H. D., Manjili, M. H. Ex vivo Expansion of Tumor-reactive T Cells by Means of Bryostatin 1/Ionomycin and the Common Gamma Chain Cytokines Formulation. J. Vis. Exp. (47), e2381, doi:10.3791/2381 (2011).

View Video