Summary

Recombinante de producción retrovirales y la infección de células B

Published: February 18, 2011
doi:

Summary

Un sistema eficiente de la estructura y análisis de la función de un gen en un<em> Ex vivo</em> Cultura de los linfocitos B del bazo se describe. Este método tiene la ventaja de la producción recombinante de antirretrovirales en una línea gratuita de ayuda, ecotrófica celular de empaquetamiento. Estables, heredables expresión de un gen de interés dentro de los linfocitos primarios se logra llevando a la generación de anticuerpos de superficie de las células B sometidos a la recombinación de cambio de clase.

Abstract

La expresión transgénica de genes en células eucariotas, es un poderoso método de genética inversa en la que se expresa un gen de interés bajo el control de un sistema de expresión heteróloga para facilitar el análisis del fenotipo resultante. Este enfoque puede ser usado para expresar un gen que no se encuentra normalmente en el organismo, para expresar una forma mutante de un gen producto, o sobre-expresa una forma dominante negativa del producto del gen. Es particularmente útil en el estudio del sistema hematopoyético, que la regulación transcripcional es un mecanismo de control importante en el desarrollo y diferenciación de células B 1, revisada en 02.04.

La genética del ratón es una herramienta poderosa para el estudio de los genes y las enfermedades. Un análisis comparativo con el ratón y el genoma humano revela la conservación de synteny en más del 90% del genoma 5. Además, gran parte de la tecnología utilizada en modelos de ratón es aplicable al estudio de los genes humanos, por ejemplo, alteraciones de genes y la sustitución alélica 6 . Sin embargo, la creación de un ratón transgénico que requiere una gran cantidad de recursos tanto de carácter financiero y técnico. Varios proyectos han comenzado a compilar las bibliotecas de eliminar cepas de ratón (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) o mutagénesis inducida por las cepas (RIKEN), que requieren grandes esfuerzos y la colaboración 7. Por lo tanto, es deseable que el primer estudio del fenotipo de un gen deseado en un modelo de cultivo celular de células primarias antes de pasar a un modelo de ratón.

ADN retroviral se integra en el ADN del huésped, de preferencia dentro de o cerca de las unidades de transcripción o de las islas CpG, lo estable y heredable expresión del gen de empaquetado de interés y evitar el silenciamiento transcripcional 8 9. Los genes se transcriben bajo el control de un promotor de la eficiencia retroviral de alta, resultando en una alta eficiencia de la transcripción y la producción de proteínas. Por lo tanto, la expresión retroviral se puede utilizar con las células que son difíciles de transfectar, siempre y cuando las células están en un estado activo durante la mitosis. Debido a que los genes estructurales del virus se encuentran dentro de la línea celular de empaquetamiento, los vectores de expresión que se usa para clonar el gen de interés no contienen genes estructurales del virus, que no sólo elimina la posibilidad de reversiones viral y aumenta la seguridad de trabajar con los sobrenadantes virales como no viriones infecciosos se producen 10.

Aquí se presenta un protocolo para la producción recombinante de retrovirales y la posterior infección de las células B del bazo. Tras el aislamiento, las células del bazo cultivadas son estimulados con linfocinas Th derivados y anti-CD40, lo que induce a una explosión de la proliferación de células B y diferenciación 11. Este protocolo es ideal para el estudio de los acontecimientos que se presentan en el desarrollo de células B y la diferenciación, las células B están aislados del bazo tras los primeros eventos hematopoyéticas, pero antes de la estimulación antigénica para inducir la diferenciación plasmáticas.

Protocol

1. Esplénica B-linfocitos Aislamiento y estimulación Cosecha del bazo de los ratones con deficiencia de AID 12 entre 2-3 meses de edad. El aislamiento del bazo se lleva a cabo en condiciones estériles y los órganos se mantienen temporalmente en solución salina fría tampón fosfato (PBS) que contiene 15% de suero fetal bovino (SFB). El bazo es transferido a una campana de cultivo de tejidos estériles y se homogeneizaron en 5 ml de PBS suplementado con FBS al 2,5%. Transferir el homo…

Discussion

Transducción retroviral de células B del bazo como se describe y representa en la figura 1 es un método genético que es útil en el estudio de los linfocitos B, porque muchos de los acontecimientos de desarrollo en lymphopoesis son controlados por la regulación transcripcional de 1, 2. En las últimas etapas de maduración de las células B, activación a través de CD40L es esencial para la inducción del crecimiento de las células B, la entrada en el ciclo celular y la proliferación …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

CK es apoyado por la Universidad de Columbia programa de postgrado. UB es miembro de la Leukemia and Lymphoma Society of America, el destinatario del Premio al Investigador de la Fundación Nueva Investigación de Leucemia y el apoyo de la Universidad de Columbia de Nueva Facultad de fondos iniciales.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
FCS   Atlanta Biologicals S11550  
RPMI   Invitrogen/Gibco 22400  
PBS   Invitrogen/Gibco 20012  
Red Blood Cell (RBC) lysis buffer   Sigma Aldrich R7757  
CD43 beads   Miltenyi    
B Cell Complete Media   Various components Various Components RPMI, 15% FCS, 1% Non-Essential Amino Acids, 1% Sodium Pyruvate, 1% HEPES, 1% Pen-Strep, 50μM β-Mercaptoethanol
IL-4        
Anti-CD40   BD Pharmigen 553787  
polybrene   Sigma Aldrich 107689 
  
Chloroquine diphosphate salt   Sigma Aldrich C6628 Used at 100mM
Phoenix Eco cells (Murine)   Orbigen RVC-10002  
PE-Cy5-α-mouse-CD45R (B220)   eBioscience 15-0452-81  
PE-α-mouse-IgG1   BD Pharmigen A85-1  

References

  1. Bartholdy, B., Matthias, P. Transcriptional control of B cell development and function. Gene. 327, 1-23 (2004).
  2. Henderson, A., Calame, K. Transcriptional regulation during B cell development. Annu Rev Immunol. 16, 163-200 (1998).
  3. Graf, T. Differentiation plasticity of hematopoietic cells. Blood. 99, 3089-30101 (2002).
  4. Xiao, C., Rajewsky, K. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 136, 26-36 (2009).
  5. Waterston, R. H. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature. 420, 520-562 (2002).
  6. Griffiths, A. J. F., Miller, J. H., Suzuki, D. T., Lewontin, R. C., Gelbart, W. M. . Introduction to Genetic Analysis. , (2000).
  7. Gondo, Y. Next-generation gene targeting in the mouse for functional genomics. BMB Rep. 42, 315-3123 (2009).
  8. Plachy, J. Proviruses selected for high and stable expression of transduced genes accumulate in broadly transcribed genome areas. J Virol. 84, 4204-4211 (2010).
  9. Felice, B. Transcription factor binding sites are genetic determinants of retroviral integration in the human genome. PLoS One. 4, e4571-e4571 (2009).
  10. Karavanas, G. Cell targeting by murine retroviral vectors. Crit Rev Oncol Hematol. 28, 7-30 (1998).
  11. Noelle, R. J. A 39-kDa protein on activated helper T cells binds CD40 and transduces the signal for cognate activation of B cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6550-6554 (1992).
  12. Muramatsu, M. Class switch recombination and hypermutation require activation-induced cytidine deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme. Cell. 102, 553-563 (2000).
  13. Yelle, J., Dion, M., Hamelin, C. Efficient transfection of mammalian cells with viral DNA in optimal culture conditions. J Virol Methods. 7, 321-326 (1983).
  14. Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).
  15. Fagarasan, S. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413, 639-6343 (2001).
  16. Basu, U. The AID antibody diversification enzyme is regulated by protein kinase A phosphorylation. Nature. 438, 508-5011 (2005).
  17. McBride, K. M. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).
  18. Barreto, V. M. AID from bony fish catalyzes class switch recombination. J Exp Med. 202, 733-738 (2005).
  19. Delphin, S., Stavnezer, J. Regulation of antibody class switching to IgE: characterization of an IL-4-responsive region in the immunoglobulin heavy-chain germline epsilon promoter. Ann N Y Acad Sci. 764, 123-135 (1995).
  20. Castigli, E. CD40 expression and function in murine B cell ontogeny. Int Immunol. 8, 405-411 (1996).
  21. Ballantyne, J. Efficient recombination of a switch substrate retrovector in CD40- activated B lymphocytes: implications for the control of CH gene switch recombination. J Immunol. 161, 1336-1347 (1998).

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Cite This Article
Keim, C., Grinstein, V., Basu, U. Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells. J. Vis. Exp. (48), e2371, doi:10.3791/2371 (2011).

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