B細胞の組換えレトロウイルスの生産と感染症
Summary
の遺伝子の構造と機能解析の効率的なシステム<em>生体外で</em脾臓B -リンパ球の>文化が説明されています。このメソッドは、ヘルパーフリー、ecotrophicパッケージング細胞株における組換えレトロウイルスの生産の利点を取ります。安定した、クラススイッチ組み換えを受けたB細胞上の表面の抗体の産生につながる達成される一次リンパ球内で目的遺伝子の発現を遺伝。
Abstract
真核細胞における遺伝子のトランスジェニック発現は、目的の遺伝子が生じる表現型の解析を容易にするために異種発現系の制御下で発現されている強力な逆遺伝学的アプローチです。このアプローチは、遺伝子産物の変異型を表現するために、または遺伝子産物のドミナントネガティブ型を過剰発現するように、通常の生物で発見されていない遺伝子を発現させることができる。それは転写調節が2-4でレビューB細胞1の分化における主要な制御機構である造血系の研究では特に便利です。
マウス遺伝学は、人間の遺伝子と疾病の研究のための強力なツールです。マウスとヒトのゲノムの比較解析は、ゲノム5の90％以上のシンテニーの保全を明らかにする。また、多くのマウスモデルで使用されている技術のは、例えば、遺伝子の混乱と対立遺伝子交換6ヒト遺伝子の研究にも適用可能であるただし 、トランスジェニックマウスの作成 は、財政的、技術的性質の両方のリソースが大量に必要になります。いくつかのプロジェクトでは、ノックアウトマウス系統（KOMP、EUCOMM、NorCOMM）または大規模な努力とコラボレーション7を必要とする特異的変異誘発株（理研）、のライブラリをコンパイルし始めている。したがって、それは最初のマウスモデルに進行する前に、初代培養細胞の細胞培養モデルにおける所望の遺伝子の表現型を検討することが望ましい。
レトロウイルスDNAは安定した結果、好ましくは転写単位またはCpGアイランド内、または近くに、宿主のDNAに統合されており、転写サイレンシング8 9を避けながら、関心のパッケージ化遺伝子の発現を遺伝。遺伝子は、転写とタンパク質生産の高効率で、その結果、高効率レトロウイルスプロモーターの制御下に転写されます。このため、レトロウイルス発現はトランスフェクションが困難な細胞に使用することができる、細胞が有糸分裂中にアクティブな状態で提供される。ウイルスの構造遺伝子をパッケージング細胞株内に含まれているため、目的の遺伝子をクローニングするために用いられる発現ベクターは、両方のウイルスの復帰の可能性を排除し、ウイルス上清での作業の安全性を高めるウイルス、のない構造遺伝子が含まれていないは感染性ビリオンは10を生成されませんように。
ここでは、組換えレトロウイルスの生産と脾臓B細胞のその後の感染のためのプロトコルを提示する。単離後、培養脾臓細胞はB細胞の増殖と分化11のバーストを誘導するのTh由来のリンホカイ ンと抗CD40で刺激される。このプロトコルは、B細胞は形質細胞分化を誘導するが、前の抗原刺激に対する初期造血のイベントに続いて脾臓から分離されているとして、後期B細胞の発達と分化に発生するイベントの研究に最適です。
Protocol
Discussion
ここで説明すると、 図1に示すように、脾臓B細胞のレトロウイルス導入はlymphopoesisの発達のイベントの多くは転写制御1、2によって制御されるため、B -リンパ球の研究に有用な遺伝学的ア プローチです。 B細胞の成熟の後の段階では、CD40Lを介してトリガするB細胞増殖、細胞周期への参入、および増殖11、20の誘導に必須である。 図2に示すように…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CKは、コロンビア大学大学院のプログラムによってサポートされています。 UBは、アメリカの白血病とリンパ腫協会、白血病研究基金からの新しい研究者賞の受信者のフェローであり、コロンビア大学新学部スタートアップ資金によってサポートされています。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FCS | Atlanta Biologicals | S11550 | ||
| RPMI | Invitrogen/Gibco | 22400 | ||
| PBS | Invitrogen/Gibco | 20012 | ||
| Red Blood Cell (RBC) lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | ||
| CD43 beads | Miltenyi | |||
| B Cell Complete Media | Various components | Various Components | RPMI, 15% FCS, 1% Non-Essential Amino Acids, 1% Sodium Pyruvate, 1% HEPES, 1% Pen-Strep, 50μM β-Mercaptoethanol | |
| IL-4 | ||||
| Anti-CD40 | BD Pharmigen | 553787 | ||
| polybrene | Sigma Aldrich | 107689 | ||
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma Aldrich | C6628 | Used at 100mM | |
| Phoenix Eco cells (Murine) | Orbigen | RVC-10002 | ||
| PE-Cy5-α-mouse-CD45R (B220) | eBioscience | 15-0452-81 | ||
| PE-α-mouse-IgG1 | BD Pharmigen | A85-1 |
References
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