Protocolo para produção de uma Cruz genética do parasita da malária de roedores

Summary

Cruzamentos genéticos de parasitas da malária em roedores são realizadas, alimentando dois parasitas geneticamente distintas para os mosquitos. Progênie recombinante são clonados a partir de sangue do rato depois de permitir que mosquitos a morder camundongos infectados. Este vídeo mostra como produzir cruzamentos genéticos de<em> Plasmodium yoelii</em> E é aplicável a outros parasitas da malária em roedores.

Abstract

Variação na resposta a drogas antimaláricas e na patogenicidade do parasita da malária é de importância biológica e médica. Mapas de ligação tem levado à identificação de genes de sucesso ou loci subjacentes vários traços em parasitas da malária em roedores e seres humanos ^{1-3 4-6.} O parasita da malária Plasmodium yoelii é uma das espécies de malária muitos isolados de roedores silvestres Africano e foi adaptado para crescer em laboratórios. Esta espécie se reproduz muitas das características biológicas dos parasitas da malária humana; marcadores genéticos, tais como microssatélites e amplificado comprimento de fragmentos polimorfismo (AFLP) marcadores também têm sido desenvolvidos para o parasita ^7-9. Assim, estudos genéticos em parasitas da malária em roedores podem ser realizadas para complementar a pesquisa sobre o Plasmodium falciparum. Aqui, nós demonstrar as técnicas para a produção de um cruzamento genético em P. yoelii que foram pela primeira vez foi pioneira pelos drs. David Walliker, Richard Carter, e colegas da Universidade de Edimburgo ^10.

Cruzamentos genéticos em P. yoelii e outros parasitas da malária em roedores são conduzidas por infectando camundongos Mus musculus com um inóculo contendo gametócitos de dois clones geneticamente distintos que diferem em fenótipos de interesse e permitindo que mosquitos se alimentam de camundongos infectados quatro dias após a infecção. A presença de gametócitos masculinos e femininos no sangue do rato é microscopicamente confirmada antes da alimentação. Dentro de 48 horas após a alimentação, no intestino médio do mosquito, os gametócitos haplóides diferenciam em gametas masculinos e femininos, fertilize, e formar um zigoto diplóide (Fig. 1). Durante o desenvolvimento de um zigoto em um ookinete, meiose parece ocorrer ^11. Se o zigoto é obtido através de fertilização cruzada entre os gametas dos dois parasitas geneticamente distintos, o intercâmbio genético (recombinação cromossômica e cross-overs entre as cromátides não irmãs de um par de cromossomos homólogos;. Fig. 2) pode ocorrer, resultando em recombinação de material genético de loci homólogos. Cada zigoto sofre sucessivas divisões dois nuclear, levando a quatro núcleos haplóides. Um ookinete desenvolve em um oocisto. Uma vez que os oocistos amadurece, milhares de esporozoítos (a descendência da cruz) são formados e libertados em hemoceal mosquito. Esporozoítos são colhidas das glândulas salivares e injetado em um novo hospedeiro murino, onde o desenvolvimento fase pré-eritrocítica e eritrocitárias ocorre. Formas eritrocitárias são clonados e classificados em relação aos personagens distinguir os genitores antes de mapas de ligação genética. Controle de infecções individuais clones parentais são realizadas da mesma forma como a produção de um cruzamento genético.

Protocol

Técnicas de assepsia devem ser aplicados a todos os materiais que serão administrados em animais para evitar a introdução inadvertida de agentes infecciosos exógenos em camundongos que podem confundir os resultados experimentais. 1. Infecção de ratos de laboratório com sangue Parasitas estágio Malária À temperatura ambiente, descongelar dois frascos contendo o sangue congelado parasitas da malária etapa a ser atravessada. Neste exemplo, duas cepas de roedores parasita …

Discussion

Demonstramos as técnicas para a produção de um cruzamento genético no roedor da malária Plasmodium yoelii, que também é aplicável à produção de cruzamentos genéticos em malárias outros roedores. Infecções de camundongos com único clones parentais são normalmente realizados para determinar a transmissão bem sucedida dos parasitas dos pais para garantir que os pais são competentes em produzir gametas funcionais antes de realizar uma cruz.

Transmissão bem-sucedida a…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Glyerolyte 57 solution		Cenmed	4A7833
Mouse Mus musculus		Charles River Laboratory		Female, inbred, strain Balb/C
Heat-inactivated calf serum		Invitrogen	26010-066
Phosphate buffered saline (PBS) solution		Invitrogen	10010-072	pH 7.4; Cell Culture grade
Malaria parasite Plasmodium yoelii yoelii 17XNL(1.1)		MR4	MRA-593	deposited by DJ Carucci
Malaria parasite Plasmodium yoelii nigeriensis N67		MR4	MRA-427	deposited by W Peters, BL Robinson, R Killick Kendrick
Mosquito Anopheles stephensi		MR4	MRA-128	deposited by MQ Benedict
Cellometer automatic cell counter		Nexcelom Biosciences	Cellometer Auto T4
Cellometer CP2 disposable hemacytometer		Nexcelom Biosciences	Cellometer CP2
High Pure PCR template preparation kit		Roche Applied Science	11 796 828 001
Calcium chloride		Sigma-Aldrich	C5670	Cell culture tested; insect cell culture tested
Giemsa stain, modified		Sigma-Aldrich	GS500
Ketamine hydrochloride		Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-2013-01	Pharmaceutical grade; concentration to 100 mg/mL
Potassium chloride		Sigma-Aldrich	P5405	Cell culture tested; insect cell culture tested
Sodium chloride		Sigma-Aldrich	S5886	Cell culture tested; insect cell culture tested
Trisodium citrate dihydrate		Sigma-Aldrich	S4641
Xylazine		Akorn Inc.	4811-20ml	Pharmaceutical grade; concentration to 20 mg/mL
Glass wool		VWR	32848-003
Glass capillary (1 μL)		VWR	53440-001
Hemocytometer		VWR	15170-168	Complete chamber set
Homogenizer		VWR	KT749520-0090	Pestle with matching tube, 1.5 mL

SUPPLEMENTARY MATERIALS:

• Maintenance of laboratory mice
• Maintenance of laboratory mosquitoes
• Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain
• Measurement of red blood cell density

Maintenance of laboratory mice

Females of inbred laboratory mouse strain BALB/c, aged 5 to 8 weeks old, are used in the study. Mice are housed in a standard solid-bottom polycarbonate cage with wire-bar lid, equipped with feeder and a water bottle. Mice are maintained at a constant temperature (25 ± 1°C) on 12:12 hour light:dark cycle. Mice are allowed to feed on 2018S Harlan Teklad Global 19% protein extruded rodent diet (sterilizable; from Harlan-Teklad) and supplied with acidified drinking water ad libitum. Experiments on animals are performed in accordance with the guidelines and regulations set forth by the Animal Care and Use Committee at the National Institute of Allergy and Infectious Disease under protocol LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland).

Maintenance of laboratory mosquitoes

Mosquitoes are from a laboratory-bred colony of Anopheles stephensi. The adults are maintained in nylon cages kept in a temperature- and humidity-controlled room (23 to 25°C for Plasmodium yoelii and Plasmodium chabaudi, and 19 to 21°C for Plasmodium berghei; 80 to 95% humidity; on 12:12 hours light:dark cycle). Adult mosquitoes are fed with 10% glucose and 2.00% para-aminobenzoic acid (PABA) supplemented water solution. To obtain high-quality adults, 500 larvae are grown in a low-density condition in 1 L of distilled water in a 1,000-cm³ open dish supplied with approximately 1 mg of sodium bicarbonate. After hatching, the larvae are given tetramin powder (PETCO) until they develop into the pupa stage and are transferred to the adult mosquito cages for emerging.

Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain

Using clean scissors snip off the tip (1.0 mm) of the infected mouse’s tail. Place one drop (0.5-1.0 μL) of tail blood onto a clean specimen slide. Mouse will stop bleeding in 1-2 min. Place a clean spreader slide on top of the blood drop, maintaining it at a 45° angle relative to the specimen slide, and allow the blood to adsorb to the entire width of the spreader. Hold the specimen slide and push forward the spreader slide rapidly and smoothly to produce a thin smear. Let the blood film dry, and then immerse the slides in absolute methanol. Allow the slide to air dry once more before covering it with Giemsa stain (10% Giemsa dye in distilled water). After incubating the thin blood films for 10-15 min at room temperature, carefully rinse the slides with tap water and let it air dry. Examine the number of infected red blood cells (iRBC; see Figure 3 for morphology of infected RBC) under a light microscope with immersion oil at 1000x magnification (with 100x objective lens) and calculate parasitemia (the number of iRBC per 100 RBC counted). Different strains of malaria parasites vary in growth rate and pathogenicity. Monitoring of blood stage parasitaemias can be performed 24hrs after injections, depending on the dose of the blood stage malaria parasites. For example, mice will be microscopically positive 24 hrs when injected with 10⁷ infected RBC intraperitoneally or 10⁶ infected RBC intravenously.

Measurement of red blood cell density

Like the levels of parasitaemias, red blood cell (RBC) density in infected mice varies throughout the course of infection. RBC density should be measured within 1-2 hrs before the start of the single- and mixed-clone infection and the cloning experiments. There are two methods for measurement of RBC density: a manual counting using Neubauer hemocytometer and an automatic counting using a Cellometer (Nexcelom Bioscience). In both methods, withdraw 1 μL of mouse tail blood using a glass capillary (VWR) and dilute in 10 mL of PBS and mix well. To use a Neubauer hemocytometer, load 20 μL of the suspension onto the hemacytometer. Place the hemacytometer on a light microscope with 10x objective lens. The hemacytometer contains a grid divided into 9 large squares, and 4 large squares at the corner are further divided into 16 small squares. Count the total number of cells in each of the 16 small squares in the four corner squares. To avoid counting bias or counting cells that overlap a grid line, count a cell as “in” if it overlaps the top or right lines and “out” if it overlaps the bottom or left lines. Estimate the number of cells per one small square and divide by 0.00625 (the volume of one small square is 6.25 nL). This yields the number of cells per microliter (μL). From this data, calculate the final red blood cell density by multiplying with 10,000 (a dilution factor). Rinse the cover slip and counting chamber with distilled water and 70% ethanol; air dry. Alternatively, load 20 μL of the suspension onto a Cellometer counting chamber slide. Insert the slide into a Cellometer slide chamber (the reader). Start the Cellometer software, select the “red blood cell” option, and enter a dilution factor of 10,000. Record the RBC density.