Protocol voor de productie van een genetische Kruis van het knaagdieren malariaparasieten

Summary

Genetische kruisen van knaagdieren malariaparasieten worden uitgevoerd door het voeren van twee genetisch verschillende parasieten aan muggen. Recombinant nakomelingen zijn gekloond van muizen bloed na waardoor muggen om geïnfecteerde muizen bijten. Deze video laat zien hoe de productie van genetisch kruisen van<em> Plasmodium yoelii</em> En is van toepassing op andere knaagdieren malariaparasieten.

Abstract

Variatie in reactie op antimalariamiddelen en pathogeniteit van malariaparasieten is van biologische en medische belang. Koppeling in kaart brengen heeft geleid tot succesvolle identificatie van de genen of loci die ten grondslag liggen verschillende eigenschappen in malariaparasieten van knaagdieren ^1-3 en mensen ^4-6. De malariaparasiet Plasmodium yoelii is een van de vele soorten malaria geïsoleerd van wilde Afrikaanse knaagdieren en is aangepast om te groeien in laboratoria. Deze soort reproduceert veel van de biologische kenmerken van de menselijke malariaparasieten, genetische merkers zoals microsatellieten en versterkt fragment lengte polymorfisme (AFLP) markers zijn ook ontwikkeld voor de parasiet ^7-9. Zo kunnen genetische studies in knaagdieren malariaparasieten worden uitgevoerd om het onderzoek naar Plasmodium falciparum te vullen. Hier tonen we de technieken voor het produceren van een genetische kruis in P. yoelii die voor het eerst werden ontwikkeld door Drs. David Walliker, Richard Carter, en collega's aan de universiteit van Edinburgh ^10.

Genetische kruizen in P. yoelii en andere knaagdieren malariaparasieten worden uitgevoerd door het infecteren van muizen Mus musculus met een inoculum met gametocyten van twee genetisch verschillende klonen die verschillen in fenotypen van belang en door muggen te voeden op de geïnfecteerde muizen 4 dagen na infectie. De aanwezigheid van mannelijke en vrouwelijke gametocyten in de muis bloed is microscopisch bevestigd voor het voeden. Binnen 48 uur na de voeding, in de middendarm van de mug, de haploïde gametocyten differentiëren in mannelijke en vrouwelijke gameten, bemesten, en vormen een diploïde zygote (afb. 1). Tijdens de ontwikkeling van een zygote in een ookinete, meiose lijkt voor te komen ^11. Als de zygote is afgeleid door middel van kruisbestuiving tussen gameten van de twee genetisch verschillende parasieten, genetische uitwisseling van (chromosomale herschikking en cross-overs tussen de niet-zuster chromatiden van een paar homologe chromosomen;. Fig. 2) kan optreden, wat resulteert in recombinatie van genetisch materiaal op homologe loci. Elke zygote ondergaat twee opeenvolgende nucleaire divisies, wat leidt tot vier haploïde kernen. Een ookinete ontwikkelt zich verder in een oocysten. Zodra de oocysten rijpt, zijn duizenden sporozoieten (de nakomelingen van het kruis) gevormd en komen vrij in de mug hemoceal. Sporozoieten worden geoogst uit de speekselklieren en geïnjecteerd in een nieuwe muis host, waar de pre-erytrocytaire en erytrocytaire fase van ontwikkeling plaatsvindt. Erytrocytaire vormen zijn gekloond en geclassificeerd met betrekking tot de personages onderscheiden van de ouderlijnen voorafgaand aan de genetische linkage in kaart brengen. Controle infecties van de individuele ouders klonen worden uitgevoerd op dezelfde manier als de productie van een genetische kruis.

Protocol

Aseptische technieken moeten worden toegepast op alle materialen die worden toegediend in de dieren om onbedoelde introductie van exogene ziekteverwekkers in muizen die kunnen verwarren experimentele resultaten te vermijden. 1. Infectie van laboratoriummuizen met Blood-traps malariaparasieten Bij kamertemperatuur, dooi twee flacons met daarin de bevroren bloed podium malariaparasieten te worden overschreden. In dit voorbeeld, twee knaagdier malaria parasiet gebruikte stammen zijn …

Discussion

Tonen we de technieken voor de productie van een genetische kruis in het knaagdier malaria Plasmodium yoelii, die ook van toepassing op de productie van genetisch kruisen in andere knaagdieren malarias. Infecties van muizen met enkele ouders klonen worden doorgaans uitgevoerd om een ​​succesvolle overdracht van het ouderlijk parasieten te bepalen om ervoor te zorgen dat de ouders bevoegd zijn in het produceren van functionele gameten voor het uitvoeren van een kruis.

Succesvolle…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Glyerolyte 57 solution		Cenmed	4A7833
Mouse Mus musculus		Charles River Laboratory		Female, inbred, strain Balb/C
Heat-inactivated calf serum		Invitrogen	26010-066
Phosphate buffered saline (PBS) solution		Invitrogen	10010-072	pH 7.4; Cell Culture grade
Malaria parasite Plasmodium yoelii yoelii 17XNL(1.1)		MR4	MRA-593	deposited by DJ Carucci
Malaria parasite Plasmodium yoelii nigeriensis N67		MR4	MRA-427	deposited by W Peters, BL Robinson, R Killick Kendrick
Mosquito Anopheles stephensi		MR4	MRA-128	deposited by MQ Benedict
Cellometer automatic cell counter		Nexcelom Biosciences	Cellometer Auto T4
Cellometer CP2 disposable hemacytometer		Nexcelom Biosciences	Cellometer CP2
High Pure PCR template preparation kit		Roche Applied Science	11 796 828 001
Calcium chloride		Sigma-Aldrich	C5670	Cell culture tested; insect cell culture tested
Giemsa stain, modified		Sigma-Aldrich	GS500
Ketamine hydrochloride		Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-2013-01	Pharmaceutical grade; concentration to 100 mg/mL
Potassium chloride		Sigma-Aldrich	P5405	Cell culture tested; insect cell culture tested
Sodium chloride		Sigma-Aldrich	S5886	Cell culture tested; insect cell culture tested
Trisodium citrate dihydrate		Sigma-Aldrich	S4641
Xylazine		Akorn Inc.	4811-20ml	Pharmaceutical grade; concentration to 20 mg/mL
Glass wool		VWR	32848-003
Glass capillary (1 μL)		VWR	53440-001
Hemocytometer		VWR	15170-168	Complete chamber set
Homogenizer		VWR	KT749520-0090	Pestle with matching tube, 1.5 mL

SUPPLEMENTARY MATERIALS:

• Maintenance of laboratory mice
• Maintenance of laboratory mosquitoes
• Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain
• Measurement of red blood cell density

Maintenance of laboratory mice

Females of inbred laboratory mouse strain BALB/c, aged 5 to 8 weeks old, are used in the study. Mice are housed in a standard solid-bottom polycarbonate cage with wire-bar lid, equipped with feeder and a water bottle. Mice are maintained at a constant temperature (25 ± 1°C) on 12:12 hour light:dark cycle. Mice are allowed to feed on 2018S Harlan Teklad Global 19% protein extruded rodent diet (sterilizable; from Harlan-Teklad) and supplied with acidified drinking water ad libitum. Experiments on animals are performed in accordance with the guidelines and regulations set forth by the Animal Care and Use Committee at the National Institute of Allergy and Infectious Disease under protocol LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland).

Maintenance of laboratory mosquitoes

Mosquitoes are from a laboratory-bred colony of Anopheles stephensi. The adults are maintained in nylon cages kept in a temperature- and humidity-controlled room (23 to 25°C for Plasmodium yoelii and Plasmodium chabaudi, and 19 to 21°C for Plasmodium berghei; 80 to 95% humidity; on 12:12 hours light:dark cycle). Adult mosquitoes are fed with 10% glucose and 2.00% para-aminobenzoic acid (PABA) supplemented water solution. To obtain high-quality adults, 500 larvae are grown in a low-density condition in 1 L of distilled water in a 1,000-cm³ open dish supplied with approximately 1 mg of sodium bicarbonate. After hatching, the larvae are given tetramin powder (PETCO) until they develop into the pupa stage and are transferred to the adult mosquito cages for emerging.

Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain

Using clean scissors snip off the tip (1.0 mm) of the infected mouse’s tail. Place one drop (0.5-1.0 μL) of tail blood onto a clean specimen slide. Mouse will stop bleeding in 1-2 min. Place a clean spreader slide on top of the blood drop, maintaining it at a 45° angle relative to the specimen slide, and allow the blood to adsorb to the entire width of the spreader. Hold the specimen slide and push forward the spreader slide rapidly and smoothly to produce a thin smear. Let the blood film dry, and then immerse the slides in absolute methanol. Allow the slide to air dry once more before covering it with Giemsa stain (10% Giemsa dye in distilled water). After incubating the thin blood films for 10-15 min at room temperature, carefully rinse the slides with tap water and let it air dry. Examine the number of infected red blood cells (iRBC; see Figure 3 for morphology of infected RBC) under a light microscope with immersion oil at 1000x magnification (with 100x objective lens) and calculate parasitemia (the number of iRBC per 100 RBC counted). Different strains of malaria parasites vary in growth rate and pathogenicity. Monitoring of blood stage parasitaemias can be performed 24hrs after injections, depending on the dose of the blood stage malaria parasites. For example, mice will be microscopically positive 24 hrs when injected with 10⁷ infected RBC intraperitoneally or 10⁶ infected RBC intravenously.

Measurement of red blood cell density

Like the levels of parasitaemias, red blood cell (RBC) density in infected mice varies throughout the course of infection. RBC density should be measured within 1-2 hrs before the start of the single- and mixed-clone infection and the cloning experiments. There are two methods for measurement of RBC density: a manual counting using Neubauer hemocytometer and an automatic counting using a Cellometer (Nexcelom Bioscience). In both methods, withdraw 1 μL of mouse tail blood using a glass capillary (VWR) and dilute in 10 mL of PBS and mix well. To use a Neubauer hemocytometer, load 20 μL of the suspension onto the hemacytometer. Place the hemacytometer on a light microscope with 10x objective lens. The hemacytometer contains a grid divided into 9 large squares, and 4 large squares at the corner are further divided into 16 small squares. Count the total number of cells in each of the 16 small squares in the four corner squares. To avoid counting bias or counting cells that overlap a grid line, count a cell as “in” if it overlaps the top or right lines and “out” if it overlaps the bottom or left lines. Estimate the number of cells per one small square and divide by 0.00625 (the volume of one small square is 6.25 nL). This yields the number of cells per microliter (μL). From this data, calculate the final red blood cell density by multiplying with 10,000 (a dilution factor). Rinse the cover slip and counting chamber with distilled water and 70% ethanol; air dry. Alternatively, load 20 μL of the suspension onto a Cellometer counting chamber slide. Insert the slide into a Cellometer slide chamber (the reader). Start the Cellometer software, select the “red blood cell” option, and enter a dilution factor of 10,000. Record the RBC density.