Summary

بروتوكول للانتاج من الصليب الوراثية للطفيليات الملاريا القوارض

Published: January 03, 2011
doi:

Summary

يتم تنفيذ الصلبان الجينية لطفيليات الملاريا من خلال إطعام القوارض two الطفيليات متميزة وراثيا لالبعوض. يتم استنساخ المؤتلف من سلالة الدم الماوس بعد السماح لدغة البعوض الفئران المصابة. هذا الفيديو يبين كيفية إنتاج الصلبان الجينية<em> المتصورة yoelii</em> وينطبق على غيرها من طفيليات الملاريا القوارض.

Abstract

الاختلاف في الاستجابة للأدوية المضادة للملاريا وتسببها طفيليات الملاريا من بيولوجية والأهمية الطبية. وقد أدى رسم خرائط لتحديد العلاقة ناجحة من الجينات أو الصفات الكامنة مواضع مختلفة في طفيليات الملاريا من القوارض والبشر 1-3 و 4-6. طفيلي الملاريا المنجلية yoelii هي واحدة من العديد من أنواع الملاريا المعزولة من القوارض البرية وأفريقيا وقد تم تكييفها لتنمو في المختبرات. يستنسخ هذا النوع في كثير من الخصائص البيولوجية للطفيليات الملاريا البشرية ، وقد تم أيضا علامات وراثية مثل الصغرية وتضخيم تعدد الأشكال طول جزء علامات (AFLP) وضعت للطفيلي 7-9. وبالتالي ، يمكن إجراء دراسات الجينية في طفيليات الملاريا القوارض لاستكمال البحث في المنجلية. هنا ، علينا أن نظهر للتقنيات لإنتاج عبر الجينية في P. yoelii التى كانت أول من الدكاترة. Walliker ديفيد كارتر ، ريتشارد ، وزملاؤه في جامعة أدنبرة 10.

الجينية الصلبان في P. وتجرى yoelii وغيرها من طفيليات الملاريا التي تصيب الفئران القوارض العضلة المصحف مع اللقاح يحتوي على اثنين من الحيوانات المستنسخة gametocytes متميزة وراثيا التي تختلف في الظواهر من الاهتمام والبعوض عن طريق السماح لتتغذى على الفئران المصابة بعد 4 ايام من العدوى. وأكد وجود المجهر gametocytes الذكور والإناث في الدم الماوس قبل التغذية. في غضون 48 ساعة بعد الرضاعة ، في المعي المتوسط ​​من البعوض ، علما gametocytes فرداني تفرق في الأمشاج الذكور والإناث ، وتسميد ، وتشكيل لاقحة مضاعفا (الشكل 1). أثناء وضع البويضة الملقحة إلى ookinete ، ويبدو أن الانقسام الاختزالي تحدث 11. إذا مشتق اقحة من خلال التلاقح بين الأمشاج من الطفيليات متميزتين وراثيا ، وتبادل الوراثية (الكروموسومات والاندماج تلك المبالغ عبر بين شقا الصبغي غير شقيقة زوج من الكروموزومات المتماثلة ؛ الشكل رقم 2) قد تحدث ، مما أدى إلى إعادة التركيب المادة الوراثية في مواضع مثلي. يخضع كل اقحة شعبتين النووية المتعاقبة ، مما أدى إلى فرداني النوى الأربعة. لمزيد من ookinete يتطور الى البيضة المتكيسة. بمجرد أن تنضج البيوض المتكيسة ، تتشكل من آلاف sporozoites (على سلالة الصليب) وأطلق سراحه في hemoceal البعوض. ويتم حصاد Sporozoites من الغدد اللعابية وحقنها في الفئران استضافة جديدة ، حيث قبل الكريات الحمراء والكريات الحمراء تطوير المرحلة تأخذ مكان. يتم استنساخ أشكال الكريات الحمر وتصنيفها فيما يتعلق الشخصيات المميزة للخطوط الوالدين قبل رسم خرائط الربط الجينية. تتم العدوى من الحيوانات المستنسخة السيطرة الأبوية الفردية في بنفس طريقة إنتاج عبر الجينية.

Protocol

ويجب تطبيق تقنيات التطهير لجميع المواد التي سوف تدار في الحيوانات لتفادي الاستخدام غير المتعمد للعوامل الخارجية في الفئران المعدية التي يمكن أن نخلط النتائج التجريبية. 1. إصابة فئران المختبر مع طفيليات الملاريا في الدم في مرحلة </…

Discussion

نبدي تقنيات لإنتاج عبر الجينية في الملاريا المنجلية yoelii القوارض ، وهو ينطبق أيضا على الإنتاج من الصلبان الجينية في malarias القوارض الأخرى. تتم عادة التهابات استنساخ الفئران مع الوالدين واحد لتحديد انتقال ناجحة للطفيليات الوالدين لضمان أن الوالدين هما المختصة في ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر الدكاترة راندي الكينز ، Kastenmayer روبن ، توري تيد ، دان وباري ليمان Tovi لقراءة نقدية للمخطوطات. وأيد هذا العمل من قبل برنامج بحوث جماعية لشعبة بحوث جماعية ، المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية والمعاهد الوطنية للصحة ، والبرنامج الوطني للبحوث الأساسية 973 من الصين ، # 2007CB513103. نشكر NIAID جماعية محرر بريندا راي مارشال للمساعدة.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Glyerolyte 57 solution   Cenmed 4A7833  
Mouse Mus musculus   Charles River Laboratory   Female, inbred, strain Balb/C
Heat-inactivated calf serum   Invitrogen 26010-066  
Phosphate buffered saline (PBS) solution   Invitrogen 10010-072 pH 7.4; Cell Culture grade
Malaria parasite Plasmodium yoelii yoelii 17XNL(1.1)   MR4 MRA-593 deposited by DJ Carucci
Malaria parasite Plasmodium yoelii nigeriensis N67   MR4 MRA-427 deposited by W Peters, BL Robinson, R Killick Kendrick
Mosquito Anopheles stephensi   MR4 MRA-128 deposited by MQ Benedict
Cellometer automatic cell counter   Nexcelom Biosciences Cellometer Auto T4  
Cellometer CP2 disposable hemacytometer   Nexcelom Biosciences Cellometer CP2  
High Pure PCR template preparation kit   Roche Applied Science 11 796 828 001  
Calcium chloride   Sigma-Aldrich C5670 Cell culture tested; insect cell culture tested
Giemsa stain, modified   Sigma-Aldrich GS500  
Ketamine hydrochloride   Fort Dodge Animal Health NDC 0856-2013-01 Pharmaceutical grade; concentration to 100 mg/mL
Potassium chloride   Sigma-Aldrich P5405 Cell culture tested; insect cell culture tested
Sodium chloride   Sigma-Aldrich S5886 Cell culture tested; insect cell culture tested
Trisodium citrate dihydrate   Sigma-Aldrich S4641  
Xylazine   Akorn Inc. 4811-20ml Pharmaceutical grade; concentration to 20 mg/mL
Glass wool   VWR 32848-003  
Glass capillary (1 μL)   VWR 53440-001  
Hemocytometer   VWR 15170-168 Complete chamber set
Homogenizer   VWR KT749520-0090 Pestle with matching tube, 1.5 mL

SUPPLEMENTARY MATERIALS:

  • Maintenance of laboratory mice
  • Maintenance of laboratory mosquitoes
  • Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain
  • Measurement of red blood cell density

Maintenance of laboratory mice

Females of inbred laboratory mouse strain BALB/c, aged 5 to 8 weeks old, are used in the study. Mice are housed in a standard solid-bottom polycarbonate cage with wire-bar lid, equipped with feeder and a water bottle. Mice are maintained at a constant temperature (25 ± 1°C) on 12:12 hour light:dark cycle. Mice are allowed to feed on 2018S Harlan Teklad Global 19% protein extruded rodent diet (sterilizable; from Harlan-Teklad) and supplied with acidified drinking water ad libitum. Experiments on animals are performed in accordance with the guidelines and regulations set forth by the Animal Care and Use Committee at the National Institute of Allergy and Infectious Disease under protocol LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland).

Maintenance of laboratory mosquitoes

Mosquitoes are from a laboratory-bred colony of Anopheles stephensi. The adults are maintained in nylon cages kept in a temperature- and humidity-controlled room (23 to 25°C for Plasmodium yoelii and Plasmodium chabaudi, and 19 to 21°C for Plasmodium berghei; 80 to 95% humidity; on 12:12 hours light:dark cycle). Adult mosquitoes are fed with 10% glucose and 2.00% para-aminobenzoic acid (PABA) supplemented water solution. To obtain high-quality adults, 500 larvae are grown in a low-density condition in 1 L of distilled water in a 1,000-cm3 open dish supplied with approximately 1 mg of sodium bicarbonate. After hatching, the larvae are given tetramin powder (PETCO) until they develop into the pupa stage and are transferred to the adult mosquito cages for emerging.

Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain

Using clean scissors snip off the tip (1.0 mm) of the infected mouse’s tail. Place one drop (0.5-1.0 μL) of tail blood onto a clean specimen slide. Mouse will stop bleeding in 1-2 min. Place a clean spreader slide on top of the blood drop, maintaining it at a 45° angle relative to the specimen slide, and allow the blood to adsorb to the entire width of the spreader. Hold the specimen slide and push forward the spreader slide rapidly and smoothly to produce a thin smear. Let the blood film dry, and then immerse the slides in absolute methanol. Allow the slide to air dry once more before covering it with Giemsa stain (10% Giemsa dye in distilled water). After incubating the thin blood films for 10-15 min at room temperature, carefully rinse the slides with tap water and let it air dry. Examine the number of infected red blood cells (iRBC; see Figure 3 for morphology of infected RBC) under a light microscope with immersion oil at 1000x magnification (with 100x objective lens) and calculate parasitemia (the number of iRBC per 100 RBC counted). Different strains of malaria parasites vary in growth rate and pathogenicity. Monitoring of blood stage parasitaemias can be performed 24hrs after injections, depending on the dose of the blood stage malaria parasites. For example, mice will be microscopically positive 24 hrs when injected with 107 infected RBC intraperitoneally or 106 infected RBC intravenously.

Measurement of red blood cell density

Like the levels of parasitaemias, red blood cell (RBC) density in infected mice varies throughout the course of infection. RBC density should be measured within 1-2 hrs before the start of the single- and mixed-clone infection and the cloning experiments. There are two methods for measurement of RBC density: a manual counting using Neubauer hemocytometer and an automatic counting using a Cellometer (Nexcelom Bioscience). In both methods, withdraw 1 μL of mouse tail blood using a glass capillary (VWR) and dilute in 10 mL of PBS and mix well. To use a Neubauer hemocytometer, load 20 μL of the suspension onto the hemacytometer. Place the hemacytometer on a light microscope with 10x objective lens. The hemacytometer contains a grid divided into 9 large squares, and 4 large squares at the corner are further divided into 16 small squares. Count the total number of cells in each of the 16 small squares in the four corner squares. To avoid counting bias or counting cells that overlap a grid line, count a cell as “in” if it overlaps the top or right lines and “out” if it overlaps the bottom or left lines. Estimate the number of cells per one small square and divide by 0.00625 (the volume of one small square is 6.25 nL). This yields the number of cells per microliter (μL). From this data, calculate the final red blood cell density by multiplying with 10,000 (a dilution factor). Rinse the cover slip and counting chamber with distilled water and 70% ethanol; air dry. Alternatively, load 20 μL of the suspension onto a Cellometer counting chamber slide. Insert the slide into a Cellometer slide chamber (the reader). Start the Cellometer software, select the “red blood cell” option, and enter a dilution factor of 10,000. Record the RBC density.

References

  1. Hayton, K., Ranford-Cartwright, L. C., Walliker, D. Sulfadoxine-pyrimethamine resistance in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi. Antimicrob Agents Chemother. 46, 2482-2489 (2002).
  2. Cravo, P. V. Genetics of mefloquine resistance in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi. Antimicrob Agents Chemother. 47, 709-718 (2003).
  3. Hunt, P., Cravo, P. V., Donleavy, P., Carlton, J. M., Walliker, D. Chloroquine resistance in Plasmodium chabaudi: are chloroquine-resistance transporter (crt) and multi-drug resistance (mdr1) orthologues involved?. Mol Biochem Parasitol. 133, 27-35 (2004).
  4. Yuan, J. Genetic mapping of targets mediating differential chemical phenotypes in Plasmodium falciparum. Nat Chem Biol. 5, 765-771 (2009).
  5. Su, X., Kirkman, L. A., Fujioka, H., Wellems, T. E. Complex polymorphisms in an approximately 330 kDa protein are linked to chloroquine-resistant P. falciparum in Southeast Asia and Africa. Cell. 91, 593-603 (1997).
  6. Hayton, K. Erythrocyte binding protein PfRH5 polymorphisms determine species-specific pathways of Plasmodium falciparum invasion. Cell Host Microbe. 4, 40-51 (2008).
  7. Pattaradilokrat, S., Cheesman, S. J., Carter, R. Congenicity and genetic polymorphism in cloned lines derived from a single isolate of a rodent malaria parasite. Mol Biochem Parasitol. 157, 244-247 (2008).
  8. Li, J. Hundreds of microsatellites for genotyping Plasmodium yoelii parasites. Mol Biochem Parasitol. 166, 153-158 (2009).
  9. Li, J. Typing Plasmodium yoelii microsatellites using a simple and affordable fluorescent labeling method. Mol Biochem Parasitol. 155, 94-102 (2007).
  10. Walliker, D., Carter, R., Morgan, S. Genetic recombination in malaria parasites. Nature. 232, 561-562 (1971).
  11. Sinden, R. E., Hartley, R. H. Identification of the meiotic division of malarial parasites. J Protozool. 32, 742-744 (1985).
  12. Ozaki, L. S., Gwadz, R. W., Godson, G. N. Simple centrifugation method for rapid separation of sporozoites from mosquitoes. J Parasitol. 70, 831-833 (1984).
  13. Yoeli, M., Most, H., Bone, G. Plasmodium berghei: cyclical transmission by experimentally infected Anopheles quadrimachulatus. Science. 144, 1580-1581 (1964).
  14. Landau, I., Boulard, Y. . Life cycles and Morphology. , (1978).
  15. Vanderbergh, J. P. Y., M, . Effects of temperature on sporogonic development of Plasmodium berghei. J Parasitol. 52, 559-564 (1966).
  16. Gadsby, N., Lawrence, R., Carter, R. A study on pathogenicity and mosquito transmission success in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi adami. Int J Parasitol. 39, 347-354 (2009).
  17. Pattaradilokrat, S., Culleton, R. L., Cheesman, S. J., Carter, R. G. e. n. e. encoding erythrocyte binding ligand linked to blood stage multiplication rate phenotype in Plasmodium yoelii yoelii. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 7161-7166 (2009).
  18. Pattaradilokrat, S., Cheesman, S. J., Carter, R. Linkage group selection: towards identifying genes controlling strain specific protective immunity in malaria. PLoS One. 2, e857-e857 (2007).
  19. Mackinnon, M. J., Read, A. F. Genetic Relationships between Parasite Virulence and Transmission in the Rodent Malaria Plasmodium chabaudi. Evolution. 53, 689-703 (1999).

Play Video

Cite This Article
Pattaradilokrat, S., Li, J., Su, X. Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites. J. Vis. Exp. (47), e2365, doi:10.3791/2365 (2011).

View Video