Summary

İzleme Oluşumu ve Antifungal Duyarlılık Testi için 96 Şey microtiter Levha tabanlı Yöntemi Candida albicans Biyofilmler

Published: October 21, 2010
doi:

Summary

Biz oluşumu için basit, hızlı ve sağlam bir bir yöntem tarif<em> Candida albicans</em> Biyofilm içinde hücre antifungal duyarlılık testi 96 microtiter plakalar ve kendi programını kullanarak biyofilm.

Abstract

Candida albicans, şimdi ABD hastaneleri, üçüncü en sık görülen enfeksiyon bozukluğu olan hastalarda kandidiyazis ve genişleyen bir nüfus mantar enfeksiyonlarının en sık nedeni olmaya devam etmektedir . Kandidiyazis farklı tezahürleri biyofilm oluşumu, hem ev sahibi doku ve / veya tıbbi cihazlar (yani kateter) ile ilişkilidir. Biyofilm içinde hücrelerinin konağın immün yanıtları ve antifungallerin eylem korunur Biyofilm oluşumu, negatif klinik etkileri taşır. Biz C. oluşumu için, basit, hızlı ve güçlü bir in vitro model geliştirdik albicans biyofilm antifungal duyarlılık testi için de kullanılabilir 96 mikrotiter plakalar, biyofilm. Bu testte okuma, metabolik olarak aktif fungal biyofilm hücreleri tarafından XTT azaltılması (tetrazolium tuz) dayalı, kolorimetrik. Tipik bir deneyde, antifungal duyarlılık testi için ek bir 24 saat, biyofilm oluşumu için yaklaşık 24 saat sürer. Çünkü sadeliği ve yaygın olarak kullanılan laboratuar malzemeleri ve ekipman kullanımı, bu tekniğin, biyofilm araştırma democratizes ve antifungal duyarlılık testi mantar biyofilm standardizasyon doğru önemli bir adımı temsil etmektedir.

Protocol

1. C. hazırlanması albicans C. albicans Risk Grubu 1/BSL1 mikroorganizma. Her zaman bu mikroorganizma ile çalışmak için iyi aseptik / steril teknikleri kullanmak ve biyolojik zararlı maddeleri uygun şekilde bertaraf edilmesi için kurumsal prosedürleri takip etmek hatırlıyorum. C. bir gecede kültür hazırlayın C tek bir koloni aşılanarak YPD (Maya Peptonlu Dekstroz) sıvı ortamda albicans YPD 25 ml içine a…

Discussion

Burada XTT kullanarak biyofilm içinde hücrelerin metabolik faaliyetleri ölçen bir kolorimetrik yöntemi ile birleştiğinde Candida biyofilm oluşumu için, basit, hızlı, ekonomik ve yüksek tekrarlanabilir 96 mikrotiter plate modeli açıklanmaktadır . Bu biyofilm oluşumu için 96 iyi mikrotiter plate modeli C için geliştirilmiş. albicans, ancak diğer Candida türleri için kullanılabilir. ve diğer mantar organizmalar için kolayca adapte. Bu yöntem, birden fazla param…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Laboratuvarda Biyofilm ilgili çalışmaları hibe tarafından finanse Diş ve Kraniofasial Araştırma ve Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar (JLL-R). Enstitüsü Ulusal Enstitüsü R21DE017294 ve R21AI080930 sayılı. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka NIDCR NIAID veya NIH resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Sabouraud-dextrose agar   Becton Dickinson 211584 To prepare plates for fresh subcultures of fungal isolates
YPD: Yeast peptone dextrose   US Biological Y2076 Medium for propagation of overnight liquid cultures
RPMI-1640 without sodium bicarbonate supplemented with L-glutamine   Cellgro 50-020-PB Liquid medium for biofilm formation
Morpholinepropanesulfonic acid (MOPS)   Fisher BP308 To buffer RPMI 1640
Phosphate buffered saline, PBS   Sigma P4417 Buffer for washes
XTT sodium salt   Sigma X4251 See above for preparation instructions
Ringer’s lactate   Hospira NDC0409-7953-09 For preparation of XTT solution
Menadione   Sigma M5625 Caution: hazardous by skin contact, inhalation or ingestion
Petri dishes   Fisher 08-757-12  
15 ml conical centrifuge tubes   Corning 430790  
50 ml conical centrifuge tubes   Corning 430828  
96 well microtiter plates: Polystyrene, flat-bottomed, tissue culture treated   Corning 3595  
Multichannel pipette and tips   Eppendorf    
Incubator   Any    
Microtiter plate reader   Any    

References

  1. Bachmann, S. P. In vitro activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 46, 3591-3596 (2002).
  2. Hawser, S. P., Norris, H., Jessup, C. J., Ghannoum, M. A. Comparison of a 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-t etrazolium hydroxide (XTT) colorimetric method with the standardized National Committee for Clinical Laboratory Standards method of testing clinical yeast isolates for susceptibility to antifungal agents. J Clin Microbiol. 36, 1450-1452 (1998).
  3. Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism. J Clin Microbiol. 41, 506-508 (2003).
  4. Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins. Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1773-1780 (2002).
  5. Nobile, C. J., Mitchell, A. P. C. albicans transcription factor Bcr1p: a regulator of cell-surface genes and biofilm formation. Current Biol. 15, 1150-1155 (2005).
  6. Ramage, G., Saville, S. P., Thomas, D. P., Lopez-Ribot, J. L. Candida biofilms: an update. Eukaryot Cell. 4, 633-638 (2005).
  7. Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., p, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
  8. Bachmann, S. P. Antifungal combinations against Candida albicans biofilms in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 47, 3657-3659 (2003).
  9. Ramage, G., VandeWalle, K., Bachmann, S. P., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. In vitro pharmacodynamic properties of three antifungal agents against preformed Candida albicans biofilms determined by time-kill studies. Antimicrob Agents Chemother. 46, 3634-3636 (2002).
  10. Ramage, G., VandeWalle, K., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
  11. Tellier, R., Krajden, M., Grigoriew, G. A., Campbell, I. Innovative endpoint determination system for antifungal susceptibility testing of yeasts. Antimicrob Agents Chemother. 36, 1619-1625 (1992).
  12. Nett, J., Andes, D. Candida albicans biofilm development, modeling a host-pathogen interaction. Curr Opin Microbiol. 9, 340-345 (2006).

Play Video

Cite This Article
Pierce, C. G., Uppuluri, P., Tummala, S., Lopez-Ribot, J. L. A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms. J. Vis. Exp. (44), e2287, doi:10.3791/2287 (2010).

View Video