Summary

A 96 Beh microtest piastra a base di Metodo per la Formazione di monitoraggio e test di suscettibilità antifungini Candida albicans Biofilm

Published: October 21, 2010
doi:

Summary

Descriviamo un metodo semplice, rapido e robusto per la formazione di<em> Candida albicans</em> Biofilm su 96 micropiastre bene e la sua utilità nei test di suscettibilità antifungina di cellule all'interno di biofilm.

Abstract

Candida albicans rimane la causa più frequente di infezioni fungine in una popolazione in espansione di pazienti compromessi e candidosi è ora la terza più comune infezione negli ospedali degli Stati Uniti. Diverse manifestazioni della candidiasi sono associati con la formazione di biofilm, sia su tessuti dell'ospite e / o dispositivi medici (cateteri per esempio). Formazione di biofilm svolge negative implicazioni cliniche, come le cellule all'interno del biofilm sono protetti dalla risposta immunitaria e dall'azione di antimicotici. Abbiamo sviluppato un modello semplice, veloce e robusto in vitro per la formazione di C. biofilm albicans con 96 pozzetti per microtitolazione piastre, che può anche essere utilizzato per test di suscettibilità biofilm antimicotico. La lettura di questo saggio è colorimetrico, basato sulla riduzione delle XTT (un sale di tetrazolio) da cellule metabolicamente attive biofilm fungine. Un tipico esperimento dura circa 24 ore per la formazione di biofilm, con ulteriori 24 ore per i test di suscettibilità antifungina. A causa della sua semplicità e l'utilizzo di materiali di laboratorio e attrezzature comunemente disponibili, questa tecnica democratizza ricerca biofilm e rappresenta un passo importante verso la standardizzazione dei test di suscettibilità antifungina di biofilm fungine.

Protocol

1. Preparazione di C. albicans C. albicans è un microrganismo Group Risk 1/BSL1. Ricordate sempre di usare buone tecniche asettiche / sterile per lavorare con questo microrganismo e seguire le procedure istituzionali per il corretto smaltimento dei materiali a rischio biologico. Preparare una cultura durante la notte di C. albicans in YPD (Lievito peptone destrosio) mezzo liquido inoculando una singola colonia di C. albicans in 25 ml di YPD. </…

Discussion

Qui si descrive un semplice, rapido, economico e altamente riproducibili 96 pozzetti modello micropiastre per la formazione di biofilm Candida accoppiato con un metodo colorimetrico che misura l'attività metabolica delle cellule all'interno del biofilm utilizzando XTT. Questo modello ben 96 micropiastre per la formazione di biofilm è stato originariamente sviluppato per C. albicans ma può essere utilizzato per altre Candida spp. e facilmente adattato per altri organismi fungini. Il …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biofilm attività relative al laboratorio è finanziata da sovvenzioni numerati R21DE017294 e R21AI080930 dal National Institute of Dental Research & cranio-facciali e l'Istituto nazionale per le allergie e malattie infettive (a JLL-R.). I contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale della NIDCR, il NIAID o il NIH.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Sabouraud-dextrose agar   Becton Dickinson 211584 To prepare plates for fresh subcultures of fungal isolates
YPD: Yeast peptone dextrose   US Biological Y2076 Medium for propagation of overnight liquid cultures
RPMI-1640 without sodium bicarbonate supplemented with L-glutamine   Cellgro 50-020-PB Liquid medium for biofilm formation
Morpholinepropanesulfonic acid (MOPS)   Fisher BP308 To buffer RPMI 1640
Phosphate buffered saline, PBS   Sigma P4417 Buffer for washes
XTT sodium salt   Sigma X4251 See above for preparation instructions
Ringer’s lactate   Hospira NDC0409-7953-09 For preparation of XTT solution
Menadione   Sigma M5625 Caution: hazardous by skin contact, inhalation or ingestion
Petri dishes   Fisher 08-757-12  
15 ml conical centrifuge tubes   Corning 430790  
50 ml conical centrifuge tubes   Corning 430828  
96 well microtiter plates: Polystyrene, flat-bottomed, tissue culture treated   Corning 3595  
Multichannel pipette and tips   Eppendorf    
Incubator   Any    
Microtiter plate reader   Any    

References

  1. Bachmann, S. P. In vitro activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 46, 3591-3596 (2002).
  2. Hawser, S. P., Norris, H., Jessup, C. J., Ghannoum, M. A. Comparison of a 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-t etrazolium hydroxide (XTT) colorimetric method with the standardized National Committee for Clinical Laboratory Standards method of testing clinical yeast isolates for susceptibility to antifungal agents. J Clin Microbiol. 36, 1450-1452 (1998).
  3. Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism. J Clin Microbiol. 41, 506-508 (2003).
  4. Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins. Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1773-1780 (2002).
  5. Nobile, C. J., Mitchell, A. P. C. albicans transcription factor Bcr1p: a regulator of cell-surface genes and biofilm formation. Current Biol. 15, 1150-1155 (2005).
  6. Ramage, G., Saville, S. P., Thomas, D. P., Lopez-Ribot, J. L. Candida biofilms: an update. Eukaryot Cell. 4, 633-638 (2005).
  7. Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., p, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
  8. Bachmann, S. P. Antifungal combinations against Candida albicans biofilms in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 47, 3657-3659 (2003).
  9. Ramage, G., VandeWalle, K., Bachmann, S. P., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. In vitro pharmacodynamic properties of three antifungal agents against preformed Candida albicans biofilms determined by time-kill studies. Antimicrob Agents Chemother. 46, 3634-3636 (2002).
  10. Ramage, G., VandeWalle, K., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
  11. Tellier, R., Krajden, M., Grigoriew, G. A., Campbell, I. Innovative endpoint determination system for antifungal susceptibility testing of yeasts. Antimicrob Agents Chemother. 36, 1619-1625 (1992).
  12. Nett, J., Andes, D. Candida albicans biofilm development, modeling a host-pathogen interaction. Curr Opin Microbiol. 9, 340-345 (2006).

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Cite This Article
Pierce, C. G., Uppuluri, P., Tummala, S., Lopez-Ribot, J. L. A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms. J. Vis. Exp. (44), e2287, doi:10.3791/2287 (2010).

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