Bu video midgastrula evre Drosophila embriyolar primer nöronal kültürlerin hazırlanmasında gösteriyor. Canlı kültürlerin Görüntüleme kaplama 2 gün sonra bir bikarbonat tabanlı tanımlı bir ortamda büyüme ve farklı nöronlar sonra hücreler 1 saat gösteriyor. Nöronların elektriksel olarak uyarılabilen ve sinaptik bağlantıları formu.
Bu video midgastrula evre Drosophila embriyolar primer nöronal kültürlerin yapmak için prosedür göstermektedir. Çamaşır suyu kullanarak embriyo ve kendi dechorionation toplama yöntemleri gösterilmektedir. Ağız emme borusu bağlı bir damlalıklı cam kullanarak, tüm hücreleri tek embriyolar kaldırılması göstermektedir. Kaplamasız bir cam lamel, orta (5 lt) küçük bir düşüş içine her embyro hücrelerini dağıtma yöntemi olduğunu göstermiştir. Kaplama 1 saat sonra mikroskop ile bir görünüm için tercih edilen bir hücre yoğunluğu göstermektedir. Tanımlanan orta büyüdüğü zaman hayatta hücrelerinin çoğu 12-24 saat nöritik süreçleri uzanan önce bir kez veya daha fazla kültür bölmek neuroblasts. Mikroskop aracılığıyla bir görünüm neurite akıbet seviyesini gösterir ve in vitro 2 gün sağlıklı bir kültür beklenen dallanma. Kültürleri, 22-24 ° C'de% 5 CO 2 inkübatör tanımlanan orta tabanlı basit bir bikarbonat yetiştirilen Nöritik süreçleri kültürünün ilk haftasında ayrıntılı olarak devam etmek ve komşu hücrelerden genellikle fonksiyonel sinaptik bağlantıları formu neurites ile temas yaparken. Bu kültürlerin Nöronlar voltaj kapılı sodyum, kalsiyum ve potasyum kanalları ifade ve elektriksel olarak uyarılabilen. Bu kültür sistemi nöronal farklılaşma, heyecanlanma, ve sinaps oluşumu / fonksiyon düzenleyen moleküler genetik ve çevresel faktörlerin çalışmak için yararlıdır.
Midgastrula dönem embriyoların hazırlanan Drosophila kültürlerde nöronlar in vitro farklılaşma önce bölmek çoğu neuroblast öncüleri, ortaya çıkar. Bu sistem, böylece nöronal gelişiminin çok erken evrelerinde (Rohrbaugh ve ark, 2003) önemli genetik ve çevresel faktörlerin araştırılması için eşsiz bir fırsat sağlar. Biz, tanımlanmış basit bir ortamda yetişen nöronların elektriksel olarak uyarılabilen nöronların (Lee ve O Dowd, 1999 O Dowd, 1995) fonksiyonel sinaptik bağlantıları oluşturmak ayrım ol…
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, hibe NS27501 tarafından desteklenen DKOD. Bir HHMI Profesör Grant DKOD bu iş için ek destek.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Drosophila melanogaster | Animal | Fruit flies | ||
Transferrin | Reagent | Sigma | T-1147 | 100x Stock: 10 mg/ml in water. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C. |
Insulin | Sigma | I-6634 | 200x Stock: 10 mg/ml in 0.05N HCl. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 120 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C. | |
Putrescine | Sigma | P-5780 | 100x Stock: 10 mM in ddH2O. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20 C | |
Selenium | Sigma | S-5261 | 100x Stock: 3 uM in ddH2O. Put 0.0051 g Selenium in a 15 ml tube labeled A (3 mM stock). Add 10 ml of sterile water. Take 10 ul from Tube A to Tube B with 10 ml ddH2O (3 uM stock). Filter Tube B through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C | |
Progesterone | Sigma | P-6149 | 100x Stock: 2 ug/ml 1. Add 1ml of 100% EtOH to 0.001 g Progesterone bottle 2. Add 49 ml ddH2O 3. Transfer 1 ml of this to second tube with 9 ml ddH2O 4. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate) 5. Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C | |
DDM1 | Medium | To 10 mls of DMEM add from stocks: 100 ul Transferrin, 100 ul Putrescine, 100 ul Selenium, 100 ul Progesterone, 50 ul Insulin | ||
Petri dishes | ||||
Cover-slips | Bellco Biological Glassware | 1943-00012 | Low lead glass, autoclaved. | |
Paper filter | Whatman | #1 | ||
10cc syringe | Tool |
The cultures made in this media must be maintained in a 5% CO2 incubator at about 22-24°C. We use a standard mammalian tissue culture incubator placed in a cold room and heated to 23°C. Always used autoclaved filtered water and make in containers that are reserved for media and supplements only. Never put a pH meter or stir bar used for other purposes in media.