Questo video dimostra la preparazione di colture primarie di neuroni da midgastrula fase embrioni di Drosophila. Vedute di colture vive visualizzare le celle 1 ora dopo la placcatura e neuroni differenziati dopo 2 giorni di crescita in un medium a base di bicarbonato definite. I neuroni sono elettricamente eccitabili e formare connessioni sinaptiche.
Questo video illustra la procedura per le colture primarie di neuroni da midgastrula fase embrioni di Drosophila. I metodi per la raccolta di embrioni e la loro dechorionation con candeggina sono dimostrati. Utilizzando una pipetta di vetro collegata ad un tubo di aspirazione bocca, ci illustrano la rimozione di tutte le cellule da embrioni singolo. Il metodo per disperdere le cellule di ogni embyro in una piccola (5 l) goccia di media su un vetrino di vetro non rivestito è dimostrata. Una vista attraverso il microscopio a 1 ora dopo placcatura illustra la densità delle cellule preferito. La maggior parte delle cellule che sopravvivono quando coltivate in un terreno specifico sono neuroblasti che dividono una o più volte nella cultura prima di estendere i processi neuritiche da 12-24 ore. Una vista attraverso il microscopio illustra il livello di crescita dei neuriti e la ramificazione prevista una sana cultura a 2 giorni in vitro. Le culture sono cresciute in una semplice base di bicarbonato un terreno specifico, in un 5% di CO 2 incubatore a 22-24 ° C. Processi neuritiche continuare a elaborare oltre la prima settimana di cultura e quando entrare in contatto con neuriti da cellule vicine spesso forma funzionale connessioni sinaptiche. I neuroni in queste culture, si manifestano voltaggio-dipendenti di sodio, calcio e canali del potassio e sono elettricamente eccitabili. Questo sistema di coltura è utile per lo studio molecolare dei fattori genetici e ambientali che regolano il differenziamento neuronale, eccitabilità, e formazione di sinapsi / funzione.
Nelle culture Drosophila preparati da embrioni fase midgastrula i neuroni derivano da precursori neuroblasti, molte delle quali dividono prima differenziazione in vitro. Questo sistema offre così un'occasione unica per esplorare i fattori genetici e ambientali importanti in fasi molto precoci dello sviluppo neuronale (Rohrbaugh et al., 2003). Abbiamo dimostrato che i neuroni coltivati in un mezzo semplice definito differenziarsi in neuroni elettricamente eccitabili, che formano anche funzionale connessioni sinaptiche (O Dowd, 199…
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere NS27501 a DKOD. Supporto aggiuntivo per questo lavoro da un HHMI professor Grant a DKOD.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Drosophila melanogaster | Animal | Fruit flies | ||
Transferrin | Reagent | Sigma | T-1147 | 100x Stock: 10 mg/ml in water. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C. |
Insulin | Sigma | I-6634 | 200x Stock: 10 mg/ml in 0.05N HCl. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 120 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C. | |
Putrescine | Sigma | P-5780 | 100x Stock: 10 mM in ddH2O. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20 C | |
Selenium | Sigma | S-5261 | 100x Stock: 3 uM in ddH2O. Put 0.0051 g Selenium in a 15 ml tube labeled A (3 mM stock). Add 10 ml of sterile water. Take 10 ul from Tube A to Tube B with 10 ml ddH2O (3 uM stock). Filter Tube B through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C | |
Progesterone | Sigma | P-6149 | 100x Stock: 2 ug/ml 1. Add 1ml of 100% EtOH to 0.001 g Progesterone bottle 2. Add 49 ml ddH2O 3. Transfer 1 ml of this to second tube with 9 ml ddH2O 4. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate) 5. Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C | |
DDM1 | Medium | To 10 mls of DMEM add from stocks: 100 ul Transferrin, 100 ul Putrescine, 100 ul Selenium, 100 ul Progesterone, 50 ul Insulin | ||
Petri dishes | ||||
Cover-slips | Bellco Biological Glassware | 1943-00012 | Low lead glass, autoclaved. | |
Paper filter | Whatman | #1 | ||
10cc syringe | Tool |
The cultures made in this media must be maintained in a 5% CO2 incubator at about 22-24°C. We use a standard mammalian tissue culture incubator placed in a cold room and heated to 23°C. Always used autoclaved filtered water and make in containers that are reserved for media and supplements only. Never put a pH meter or stir bar used for other purposes in media.