וידאו זה מדגים את הכנת תרבויות עצבי ראשוני midgastrula עוברים שלב תסיסנית. צפיות של תרבויות לחיות להראות תאים 1 שעה לאחר ציפוי הנוירונים הבדיל אחרי 2 ימים של גידול בינוני ביקרבונט מבוססי מוגדר. הנוירונים הם להתרגש חשמלית וליצור קשרים סינפטיים.
Abstract
וידאו זה ממחיש את הליך קבלת תרבויות עצבי ראשוני midgastrula עוברים שלב תסיסנית. שיטות לאיסוף עוברים dechorionation שלהם באמצעות אקונומיקה הם הפגינו. שימוש pipet זכוכית המחובר לצינור שאיבה בפה, אנו ממחישים את סילוק כל התאים מעוברים יחיד. השיטה לפיזור תאים מכל embyro לתוך ירידה (5 ליטר) קטן בינוני על coverslip זכוכית ללא ציפוי מודגם. מבט מבעד למיקרוסקופ בשעה 1 לאחר ציפוי ממחיש את צפיפות התאים המועדפת. רוב התאים שורדים כאשר גדל מוגדר בינוני הם neuroblasts כי לחלק אחד או יותר פעמים בתרבות לפני הרחבת תהליכי מדלקת עצבים של 12-24 שעות. מבט מבעד למיקרוסקופ ממחיש את רמת תולדה neurite ו הסתעפות צפוי בתרבות בריא 2 ימים במבחנה. תרבויות מגודלים ביקרבונט פשוטה מבוסס מוגדר בינוני, ב 5% CO 2 באינקובטור ב 22-24 ° C. תהליכים מדלקת עצבים להמשיך לפרט על השבוע הראשון בתרבות וכשהם ליצור קשר עם neurites מן התאים השכנים הם לעתים קרובות בצורה קשרים סינפטיים תפקודית. הנוירונים בתרביות אלה מבטאים מתח מגודרת נתרן, סידן, אשלגן תעלות והם להתרגש חשמלית. מערכת זו תרבות שימושי ללימוד גורמים גנטיים וסביבתיים מולקולרית המווסתים התמיינות רגישות עצבית, היווצרות הסינפסה / פונקציה.
Protocol
I. תסיסנית אוסף עובריים הכן אוסף צלחות ביצה מרתיחים 200 מ"ל DH 2 O עם אגר 8 גרם מצננים 50 ° C הוסף 2 מ"ל EtOH ו 2 מ&quo…
Discussion
בתרבויות תסיסנית מוכן מעוברים בשלב midgastrula הנוירונים נובעים מבשרי neuroblast, שרבים מהם מחלקים לפני בידול במבחנה. מערכת זו ובכך מספק הזדמנות ייחודית למחקר של גורמים גנטיים וסביבתיים חשובים בשלבים מוקדמים מאוד של התפתחות עצבית (Rohrbaugh et al., 2003). הראינו כי נוירונים שגודלו בינוני מוגדר פש?…
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH כדי להעניק NS27501 DKOD. תמיכה נוספת עבור עבודה זו של פרופ 'HHMI מענק DKOD.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Drosophila melanogaster
Animal
Fruit flies
Transferrin
Reagent
Sigma
T-1147
100x Stock: 10 mg/ml in water. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Insulin
Sigma
I-6634
200x Stock: 10 mg/ml in 0.05N HCl. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 120 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Putrescine
Sigma
P-5780
100x Stock: 10 mM in ddH2O. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20 C
Selenium
Sigma
S-5261
100x Stock: 3 uM in ddH2O. Put 0.0051 g Selenium in a 15 ml tube labeled A (3 mM stock). Add 10 ml of sterile water. Take 10 ul from Tube A to Tube B with 10 ml ddH2O (3 uM stock). Filter Tube B through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
Progesterone
Sigma
P-6149
100x Stock: 2 ug/ml
1. Add 1ml of 100% EtOH to 0.001 g Progesterone bottle
2. Add 49 ml ddH2O
3. Transfer 1 ml of this to second tube with 9 ml ddH2O
4. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate)
5. Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
DDM1
Medium
To 10 mls of DMEM add from stocks:
100 ul Transferrin,
100 ul Putrescine,
100 ul Selenium,
100 ul Progesterone,
50 ul Insulin
Petri dishes
Cover-slips
Bellco Biological Glassware
1943-00012
Low lead glass, autoclaved.
Paper filter
Whatman
#1
10cc syringe
Tool
The cultures made in this media must be maintained in a 5% CO2 incubator at about 22-24°C. We use a standard mammalian tissue culture incubator placed in a cold room and heated to 23°C. Always used autoclaved filtered water and make in containers that are reserved for media and supplements only. Never put a pH meter or stir bar used for other purposes in media.
Sicaeros, B., O’Dowd, D. K. Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (5), e226, doi:10.3791/226 (2007).