Summary

Visualizzazione dei nervi larvali segmentale in 3 Rd Instar Drosophila I preparativi larvali

Published: September 29, 2010
doi:

Summary

Larve di Drosophila melanogaster fornire un sistema modello ideale per studiare i meccanismi di trasporto assonale in nervi larvale segmentale. Utilizzando questa procedura, 3 ° larve instar portatori di mutazioni varie può essere paragonato a larve wild-type.

Abstract

Drosophila melanogaster sta emergendo come un potente sistema modello per studiare lo sviluppo e la funzione del sistema nervoso, in particolare a causa della sua genetica e conveniente genoma completamente sequenziato. Inoltre, il sistema nervoso larvale è un sistema modello ideale per studiare i meccanismi del trasporto assonale, come i nervi larvale segmentale contenere fasci di assoni con i loro corpi cellulari situato all'interno del cervello e le loro terminazioni nervose finale lungo la lunghezza del corpo. Qui si descrive la procedura per la visualizzazione di proteine ​​delle vescicole sinaptiche all'interno larvale nervi segmentale. Se fatto correttamente, tutte le componenti del sistema nervoso, con relativi tessuti come i muscoli e NMJs, rimane intatto, integro e pronto per essere visualizzato. 3 ° larve instar portatori di mutazioni diverse sono sezionati, fisso, incubate con anticorpi delle vescicole sinaptiche, visualizzati e confrontati con le larve wild-type. Questa procedura può essere adattata per diversi anticorpi diversi sinaptica o neuronale e cambiamenti nella distribuzione di una varietà di proteine ​​può essere facilmente osservata entro larvale nervi segmentale.

Protocol

1. Preparazione dei reagenti Preparare 1x buffer Dissection a 128 mM NaCl, CaCl 2 4mm, 4 mm MgCl 2, 2 mM KCl, HEPES 5 mm e 36 mm saccarosio. Il pH della soluzione a 7,2 e filtro sterilizzare. Preparare il fissativo con diluizione 1:1 del 16% di formaldeide e Buffer Dissection 1x. Preparare 1x PBT utilizzando 1x soluzione tampone fosfato (PBS) a pH di 7,2 e Triton X-100 in un rapporto 1:100. Preparare il 5% di albumina sierica bovina (BSA) con 0,01% Na azide …

Discussion

I nervi larvale Drosophila segmentale sono un potente sistema per lo studio dei meccanismi di trasporto assonale. Se il 3 ° instar dissezione larvale viene eseguita correttamente, tutte le componenti del sistema nervoso centrale, PNS, e tessuti associati, come i muscoli e NMJs, possono essere esaminate all'interno di una singola larva. Abbiamo adattato questo protocollo da quella pubblicata da Hurd e Saxton (1996). Questo protocollo può essere adattato anche a test altri anticorpi neuronali, ma…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

SG è sostenuto da fondi del State University di New York a Buffalo e da John R. Oishei Foundation.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Dumont #5 Forceps   Fine Science Tools, Inc. 11252-20  
Minutien Pins, Stainless Steel   Fine Science Tools, Inc. 26002-10  
Mcpherson-Vannas Straight Blade 8cm Scissors   Fisher Scientific 50822236  
Vectashield, Mounting Medium   Vector Laboratories, Inc. H-1000  
Sylgard 184 Silicone elastomer   Dow Corning Corporation 4026148  
formaldehyde, 16%   Electron Microscopy Sciences 15710  
dCSP3   Developmental Studies Hybridoma Bank    
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG   Invitrogen A-11004  

References

  1. Gunawardena, S., Goldstein, L. Disruption of Axonal Transport and Neuronal Viability by Amyoid Precursor Protein Mutations in Drosophila. Neuron. 32 (2), 389-401 (2001).
  2. Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40 (1), 1-2 (2003).
  3. Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Genetics. 144 (3), 1075-1085 (1996).
  4. Zinsmaier, K. E., Eberle, K. K., Buchner, E., Walter, N., Benzer, S. Paralysis and early death in cysteine string protein mutants of Drosophila. Science. 263, 977-980 (1994).

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Cite This Article
Fye, S., Dolma, K., Jung Kang, M., Gunawardena, S. Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations. J. Vis. Exp. (43), e2128, doi:10.3791/2128 (2010).

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