このプロトコルは、非放射性の関係<em>その場</em脊椎動物の脳の薄片で、単一セルの解像度で、二つの転写産物の種の同時同定を可能にする>ハイブリダイゼーション手順。
ここでは、二重蛍光の修正版を説明<em>その場で</em>ハイブリダイゼーション(dFISH)メソッドでは、新鮮凍結脳切片における関心のある2 mRNAを検出するために最適化。当社グループは、正常遺伝子の共同規制を研究するためにこのアプローチを使用しています。具体的には、我々は単一細胞の解像度で、解剖学的組織、神経化学的特性、および中央の感覚回路の感覚経験の影響を調べるためにこのdFISHのメソッドを使用している。このプロトコルは、マウス、ラット、鳴禽類の脳組織で検証されていますが、非神経組織の配列にだけでなく、他の脊椎動物種に容易に適用可能であることを期待されている。この映画では、この手順の主なステップの詳細なデモンストレーションを提供しています。
我々は、脊椎動物の脳がneurochemicallyと機能的に編成されているか研究し、そしてどのように行動に関連した感覚刺激の影響成人の脳の8-10の神経細胞のゲノム機械かを判断するためにこのプロトコルを使用している。我々は正常マウス、ラット、鳴禽類の脳組織でこのメソッドを使用していましたが、このプロトコルは、脊椎動物種の配列と、おそらく、非神経組織から得られた脳切?…
The authors have nothing to disclose.
NIH / NIDCDとRPへのシュミット財団の助成金によってサポートされている動作。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
DEPC | VWR | IC15090225 | toxic substance | |
PCR purification kit | QIAgen | 28104 | ||
Formaldehyde | VWR | BDH0506-4LP | toxic substance | |
T3 RNA polymerase | Roche | 11031163001 | ||
T7 RNA polymerase | Roche | 10881767001 | ||
Tris-HCl (1 M, pH 7.5) | VWR | IC816124 | ||
MgCl2 (1 M) | Sigma | 449172 | ||
Spermidine (1 M) | Sigma | S0266 | ||
DIG RNA labeling mix | Roche | NC9380805 | ||
Biotin RNA labeling mix | Roche | NC9440104 | ||
RNasin | Promega | N2111 | ||
BSA | Sigma | 05491 | ||
DTT | Sigma | D5545 | ||
Sephadex G50 | VWR | 95016-772 | ||
EDTA | VWR | 101384-758 | ||
SDS | Sigma | L4390 | ||
Transfer (t)RNA | Invitrogen | 15401011 | ||
10X MOPS | VWR | 14221-398 | toxic substance | |
Paraformaldehyde | VWR | AAAL04737-36 | toxic substance | |
Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | ||
Sodium phosphate dibasic | Sigma | S3264 | ||
NaOH | VWR | SX0600-1 | ||
Triethanolamine | VWR | IC15216391 | ||
Acetic anhydride | VWR | MK242002 | toxic substance | |
SSPE | VWR | 82021-488 | ||
Formamide | VWR | JT4028-1 | toxic substance | |
Poly A | Invitrogen | POLYA.GF | ||
Mineral oil | VWR | IC15169491 | ||
Chloroform | VWR | BDH1109 | organic solvent | |
Deionized formamide | Sigma | F9037 | toxic substance | |
Hydrogen peroxide | VWR | VW36901 | toxic substance | |
Tween 20 | Sigma | P1379 | ||
Triton X-100 | J. T. Baker | X198-05 | ||
Anti-DIG HRP | Roche | 11093274910 | ||
Anti-biotin peroxidase | Vector | SP3010 | ||
TSA Alexa Fluor 594 | Invitrogen | T20935 | ||
TSA Alexa Fluor 488 | Invitrogen | T20932 | ||
Hoechst | VWR | 200025-538 | ||
Vectashield | Vector | H-1000 | ||
embedding mold | VWR | 15160-157 | ||
cryostat | Leica | CM 1850 | ||
Superfrost plus slide | VWR | 89033-052 |
Solutions