פרוטוקול זה כרוך לא רדיואקטיבי<em> ב-situ</em> הליך הכלאה המאפשר זיהוי סימולטני של שני מינים התמליל, ברזולוציה של תא בודד, בסעיפים דק של המוח החולייתנים.
כאן אנו מתארים גירסה שונה של פלואורסצנטי כפול<em> באתרו</em> (DFISH) שיטה הכלאה מותאם לאיתור two mRNAs עניין טרי חלקים במוח קפוא. הקבוצה שלנו השתמשה בהצלחה גישה זו במחקר גנטי משותף תקנה. באופן ספציפי יותר, השתמשנו בשיטה זו dFISH לחקור את ארגון אנטומי, תכונות neurochemical, ואת ההשפעה של החוויה החושית במעגלים החושית המרכזית, ברזולוציה של תא בודד. פרוטוקול זה קיבל תוקף ברקמת המוח של עכברים, חולדות ציפורי שיר אך צפוי להיות להתאמה בקלות למינים חוליות אחרים, כמו גם מערך של אי – עצביים לרקמות. בסרט זה אנו מספקים הפגנה מפורט של הצעדים העיקריים של הליך זה.
השתמשנו בפרוטוקול זה כדי ללמוד כיצד המוח חוליות מאורגן neurochemically והן מבחינה תפקודית, ולקבוע כיצד התנהגותית הרלוונטיים השפעת גירויים חושיים מנגנון גנטי של נוירונים במוח מבוגר 80-10. השתמשנו בשיטה זו בהצלחה ברקמת המוח של עכברים, חולדות, ציפורי שיר, אבל צופים כי פרוט…
The authors have nothing to disclose.
עבודה נתמך על ידי מענקים של NIH / NIDCD וקרן שמיט אל RP.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
DEPC | VWR | IC15090225 | toxic substance | |
PCR purification kit | QIAgen | 28104 | ||
Formaldehyde | VWR | BDH0506-4LP | toxic substance | |
T3 RNA polymerase | Roche | 11031163001 | ||
T7 RNA polymerase | Roche | 10881767001 | ||
Tris-HCl (1 M, pH 7.5) | VWR | IC816124 | ||
MgCl2 (1 M) | Sigma | 449172 | ||
Spermidine (1 M) | Sigma | S0266 | ||
DIG RNA labeling mix | Roche | NC9380805 | ||
Biotin RNA labeling mix | Roche | NC9440104 | ||
RNasin | Promega | N2111 | ||
BSA | Sigma | 05491 | ||
DTT | Sigma | D5545 | ||
Sephadex G50 | VWR | 95016-772 | ||
EDTA | VWR | 101384-758 | ||
SDS | Sigma | L4390 | ||
Transfer (t)RNA | Invitrogen | 15401011 | ||
10X MOPS | VWR | 14221-398 | toxic substance | |
Paraformaldehyde | VWR | AAAL04737-36 | toxic substance | |
Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | ||
Sodium phosphate dibasic | Sigma | S3264 | ||
NaOH | VWR | SX0600-1 | ||
Triethanolamine | VWR | IC15216391 | ||
Acetic anhydride | VWR | MK242002 | toxic substance | |
SSPE | VWR | 82021-488 | ||
Formamide | VWR | JT4028-1 | toxic substance | |
Poly A | Invitrogen | POLYA.GF | ||
Mineral oil | VWR | IC15169491 | ||
Chloroform | VWR | BDH1109 | organic solvent | |
Deionized formamide | Sigma | F9037 | toxic substance | |
Hydrogen peroxide | VWR | VW36901 | toxic substance | |
Tween 20 | Sigma | P1379 | ||
Triton X-100 | J. T. Baker | X198-05 | ||
Anti-DIG HRP | Roche | 11093274910 | ||
Anti-biotin peroxidase | Vector | SP3010 | ||
TSA Alexa Fluor 594 | Invitrogen | T20935 | ||
TSA Alexa Fluor 488 | Invitrogen | T20932 | ||
Hoechst | VWR | 200025-538 | ||
Vectashield | Vector | H-1000 | ||
embedding mold | VWR | 15160-157 | ||
cryostat | Leica | CM 1850 | ||
Superfrost plus slide | VWR | 89033-052 |
Solutions