L'identification des gènes induite par une dysrégulation de Kaposi associé au sarcome de Herpesvirus (KSHV)
Summary
Facteurs de la cellule hôte jouent un rôle essentiel dans la création et l'entretien du sarcome de Kaposi (SK). Nous présentons des méthodes pour identifier les facteurs de la cellule hôte modifiée en KSHV cellules infectées DMVEC, et dans le tissu tumoral KS. Gènes cellulaires altérés par le virus de se servir de cible potentielle (s) pour de nouveaux traitements.
Abstract
Actuellement KS est le plus prédominant du VIH / sida cancer liés à l'Afrique australe et par conséquent le monde 1,2. Elle se caractérise comme une tumeur angioproliferative des cellules endothéliales vasculaires et produit les maladies rares cellules B lymphoprolifératifs sous la forme de lymphomes épanchement pleural (PEL) et certaines formes de maladie de Castleman multicentrique. 3-5 seulement 1-5% des cellules dans les lésions KS soutenir activement la réplication lytique du sarcome de Kaposi associé herpèsvirus (KSHV), l'agent étiologique associé à KS, et il est clair que des facteurs cellulaires doivent interagissent avec des facteurs viraux dans le processus d'oncogenèse et la progression tumorale. Identifier 6,7 roman hôte facteur déterminants qui contribuent à la pathologie KS est essentiel pour le développement de marqueurs pronostiques de la progression tumorale et les métastases, ainsi que pour développer de nouvelles thérapies pour le traitement de KS 8. Les détails vidéo d'accompagnement des méthodes que nous utilisons pour identifier l'hôte cellulaire programmes d'expression génique altérée dans les cellules endothéliales microvasculaires dermiques (DMVEC) après l'infection KSHV et dans le tissu tumoral KS. 9 fois gènes dérégulé sont identifiés par l'analyse des microréseaux, des changements dans l'expression des protéines sont confirmée par immunoblot et double immunofluorescence étiquetés. Les changements dans l'expression transcriptionnelle de gènes dérégulé sont confirmés in vitro par quantitative en temps réel la réaction en chaîne polymérase (PCR qRT). Validation des résultats in vitro en utilisant des archives tissu tumoral KS est également effectuée par immunochimie étiquetés double et tissue microarrays. 8,10 Notre approche pour identifier les gènes dérégulé dans le microenvironnement KS tissu tumoral permettra le développement d'études in vitro et par la suite dans des systèmes modèles in vivo pour découverte et l'évaluation des thérapeutiques nouvelles potentielles pour le traitement du sarcome de Kaposi.
Protocol
Discussion
Les méthodologies utilisées dans ce rapport peuvent être effectuées dans une variété de paramètres de laboratoire. Ils exigent un équipement spécial ou d'accès aux installations de base. Précautions appropriées doivent être prises lorsque vous faites des expériences impliquant des agents pathogènes viraux tels infectieuses KSHV qui peut nécessiter l'utilisation d'un niveau biosaftey 3 (BSL-3) des installations. Acquisitions de tissus doivent également être approuvée par les conseils approp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions James EK Hildreth, Meharry Medical College, pour ses conseils et de l'examen de ce manuscrit. Nous remercions également Diana Marver pour l'édition du manuscrit. Ce travail a été soutenu par le Centre Meharry Vanderbilt for AIDS Research (NIH P30 AI054999-05), le Centre de santé Disparités recherche sur le sida, NIH 5U54 RR019192-05, le Centre pour la recherche clinique Meharry, des subventions du NIH P20RR011792, et par le NIH subventions P01 CA113239. JAA a été partiellement financé par des subventions pilotes à partir du Centre Vanderbilt-Meharry recherche sur le sida (CFAR) et le Centre pour la recherche clinique Meharry (CRC).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Invitrogen | 05-0001DJ | ||
| TPA | Sigma | P1585 | ||
| PBS pH 7.4 | Invitrogen | 10010-023 | ||
| Sodium butyrate | Sigma | 19364 (FLUKA) | ||
| EBM-2 media | Lonza | CC-3156 | + bullet kits supplement | |
| DMVEC cells (HMVEC) | Lonza | CC2543 | ||
| Fetal calf serum | Hyclone | SH30066.03 | ||
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
| Chamber slides | Nalgene | 154461 | ||
| KSHV LANA Mab | Vector Labs | VP-H913 | 1:50 dilution/IFA | |
| Galectin-3 goat pAb | R&D Systems | AF1154 | ||
| Donkey-anti-goat FITC | Jackson ImmunoRessearch | 705-095-1 | ||
| Donkey-anti-goat Rho | Jackson ImmunoRessearch | 705-295-003 | 1:100 dilution/IFA | |
| Mounting media | Vector Labs | H 1500 | Vectashield with DAPI | |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23235 | ||
| Nitrocellulose | Bio-Rad | 161-0112 | ||
| Donkey-anti-goat-conj. | Santa Cruz | SC 2020 | ||
| Western substrate | Pierce | 34075 | ||
| Biotin-rabbit-anti goat | DAKO | 305-065-045 | ||
| AP-Strepavidin conj. | DAKO | K 0492 (kit) | ||
| RNase DNase Free Set | Qiagen | 79254 | ||
| MJ Mini Cycler | Bio-Rad | PTC-1148C | ||
| Bio-Photometer | Eppendorf | 952000006 | ||
| RC 6 Plus Centrifuge | Sorvall | 46910 | ||
| Coulter Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman | 392052 | ||
| MYiQ iCycler Real Time PCR Detection System | Bio-Rad | 170-9770 | ||
| TE 2000S Fluorescent microscope | NIKON | TE2000S | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938C | ||
| Eclipse E 200 | NIKON | E 200 | ||
| Sorvall Legend RT Centrifuge | Thermo | 75004377 |
References
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