Summary

Indução transuretral de rato infecção urinária

Published: August 05, 2010
doi:

Summary

Este vídeo vai demonstrar os métodos para induzir transurethrally infecções do trato urinário do mouse e quantificar a extensão das infecções resultantes.

Abstract

Cepas bacterianas uropathogenic de interesse são cultivadas em ágar. Geralmente uropathogenic,<em> E. coli</em> (UPEC) e de outras variedades podem ser cultivadas durante a noite em Luria-Bertani (LB) ágar a 37 ° C no ar ambiente. Cepas UPEC crescer como branco-amarelada translúcida colônias em ágar LB. Após a confirmação da morfologia da colônia apropriado, colônias individuais são, então, escolhido para ser cultivado em caldo. LB pode ser usado para cepas mais uropathogenic bacteriana. Dois serial, culturas caldo LB noite pode ser empregada para aumentar a expressão do pili tipo I, um fator de virulência bem definidos para as bactérias uropathogenic. Culturas caldo são diluídos para a concentração desejada em tampão fosfato salino (PBS). De oito a 12 semanas de idade camundongos fêmeas são colocadas sob anestesia com isoflurano e transurethrally inoculadas com bactérias usando tubos de polietileno coberta de 30 seringas de calibre. Inóculos típico, que deve ser determinado empiricamente para cada combinação estirpe bacteriana / mouse, são 10<sup> 6</sup> A 10<sup> 8</sup> Ufc por rato em 10 a 50 microlitros de PBS. Após o período de infecção desejado (um dia a várias semanas), amostras de urina e da bexiga e os rins são colhidos. Cada órgão é picada, colocados em PBS e homogeneizadas em um homogeneizador de bala azul. Homogeneizados de urina e tecido são serialmente diluída em PBS e cultivadas em ágar apropriado. No dia seguinte, as unidades formadoras de colónias são contadas.

Protocol

I. Elaboração de cateteres uretrais Para cada bexiga e rim do rato a amostrar, coloque 5-6 grânulos de aço inoxidável (bexiga, 1,6 mm ou tamanho 0,9-2,0 mistura mm) ou grânulos de óxido de zircônio (rim, tamanho 0,5 mm) em um tubo de cryovial, respectivamente. Autoclave os tubos contendo talão. Após os tubos esfriarem até a temperatura ambiente, adicionar 200 microlitros de PBS estéril a cada tubo de aço inoxidável contendo talão e 400 microlitros de PBS estéril a cada tubo de óxido…

Discussion

Indução de rato infecção do trato urinário por inoculação de bactérias transuretral é um procedimento estabelecido há muito tempo, mas tecnicamente exigente 11. Hung e Hultgren publicou recentemente uma excelente revisão das técnicas de ressecção transuretral de mouse infecção do trato urinário 13. Neste trabalho, tentamos ilustrar ainda mais os pontos mais delicados desta abordagem experimental.

Novatos podem praticar a sua técnica através da realiza…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer Shelly Xie e Jennifer Payne por sua assistência técnica especializada. Este trabalho foi possível através de doações da Sociedade de Urologia Pediátrica e do Fundo de Investigação Pediátrica Stanford.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Cryovial tubes, 2.0 ml polypropylene (no caps)   E&K Scientific 640201  
Caps for cryovial tubes, with ‘O’ ring   E&K Scientific 440011-N  
Bullet Blender   Next Advance BBX24  
Zirconium Oxide Beads (0.5mm)   Next Advance ZROB05  
Stainless Steel Beads (1.6mm)   Next Advance SSB16  
Stainless Steel Bead Blend (0.9-2.0mm)   Next Advance SSB14B  
CBA/J Mice, 8-12 week old female   Jackson Laboratories 000656  
Phosphate Buffered Saline (NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 4.3mM, KH2PO4 1.4mM)   EMD EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na2HPO4) EM-5108-1 (KH2PO4)  
LB agar        
LB broth   EMD 1.10285.0500  
Isoflurane (Aerrane)   Baxter NDC 10019-773-60  
Inoculating loops   Fisher Scientific 22-363-601  
Eosin-methylene blue (EMB) agar powder   Himedia Laboratories MM022-500G  
MacConkey agar powder   Difco 212123  
LB agar powder   Difco 244520  
Intramedic non-radiopaque polyethylene tubing, PE10 [inner dimension 0.28 mm (0.011 inch); outer dimension 0.61 mm (0.024 inch)]   BD Biosciences 427401  
30 gauge needles, 1/2 inch   BD Biosciences 305106  
1 ml tuberculin Slip-Tip syringe   BD Biosciences 309602  
3 ml Luer-Lock syringe   BD Biosciences 309585  

References

  1. Schaeffer, A. J., Schwan, W. R., Hultgren, S. J., Duncan, J. L. Relationship of type 1 pilus expression in Escherichia coli to ascending urinary tract infections in mice. Infect Immun. 55, 373-380 (1987).
  2. Rouschop, K. M. Urothelial CD44 facilitates Escherichia coli infection of the murine urinary tract. J Immunol. 177, 7225-7232 (2006).
  3. Malaviya, R., Ikeda, T., Abraham, S. N. Contribution of mast cells to bacterial clearance and their proliferation during experimental cystitis induced by type 1 fimbriated E. coli. Immunol LettM. 91, 103-111 (2004).
  4. Lane, M. C., Alteri, C. J., Smith, S. N., Mobley, H. L. Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16669-16674 (2007).
  5. Hvidberg, H. Development of a long-term ascending urinary tract infection mouse model for antibiotic treatment studies. Antimicrob Agents Chemother. 44, 156-163 (2000).
  6. Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model. J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).
  7. Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. Infect Immun. 66, 2798-2802 (1998).
  8. Gunther, N. W. t., Lockatell, V., Johnson, D. E., Mobley, H. L. In vivo dynamics of type 1 fimbria regulation in uropathogenic Escherichia coli during experimental urinary tract infection. Infect Immun. 69, 2838-2846 (2001).
  9. Bishop, B. L. Cyclic AMP-regulated exocytosis of Escherichia coli from infected bladder epithelial cells. Nat Med. 13, 625-630 (2007).
  10. Thumbikat, P., Waltenbaugh, C., Schaeffer, A. J., Klumpp, D. J. Antigen-specific responses accelerate bacterial clearance in the bladder. J Immunol. 176, 3080-3086 (2006).
  11. Hagberg, L. Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin. Infect Immun. 40, 273-283 (1983).
  12. Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model. J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).
  13. Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nat Protoc. 4, 1230-1243 (2009).

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Cite This Article
Thai, K. H., Thathireddy, A., Hsieh, M. H. Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection. J. Vis. Exp. (42), e2070, doi:10.3791/2070 (2010).

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