Сравнительный В естественных условиях Изучение иммуногенности gp96 в Лягушка Xenopus laevis</em
Summary
Лягушка<em> Xenopus laevis</em> Обеспечивает привлекательную альтернативу не-млекопитающих моделью для изучения способности белка теплового шока, такие как gp96 содействовать антиген-специфических CD8 ответа Т-клеток. Мы представляем методы исследования<em> В естественных условиях</em> Содействие кросс-презентация кожи и опухолевых антигенов gp96.
Abstract
Мы разработали в амфибии Xenopus laevis уникальный не-млекопитающих моделью для изучения способности определенных белков теплового шока (HSPs), таких как gp96 для облегчения кросс-презентация присмотром антигенов и вызывают врожденные и адаптивные Т-клеточные реакции. Xenopus кожи отторжения трансплантата обеспечивает отличную платформу для изучения способности gp96, чтобы выявить классической MHC класса Ia (класс Ia) ограничено Т-клеточные реакции. Кроме того, система Xenopus Модель также предлагает привлекательную альтернативу для мышей для изучения способности gp96 для генерации ответа против опухолей, которые имеют вниз регулируется их класса Ia молекул тем самым избежать иммунного надзора. В последнее время мы разработали приемных анализа передачи ячейки в Xenopus клонов использовании перитонеального лейкоцитов как антиген представляющих клеток (БТР), и показали, что gp96 может премьер CD8 Т-клеточного ответа в естественных условиях от незначительных антигенов гистосовместимости кожи, а также против опухоли тимуса Xenopus 15 / 0, что не выражает молекул класса Ia. Мы описываем здесь методология участие для выполнения этих анализов в том числе выявление, пульсирующая и приемных передачи перитонеального лейкоцитов, а также трансплантата кожи и опухоли анализы трансплантации. Кроме того, мы также описания уборки и разделения лейкоцитов периферической крови используется для проточной цитометрии и распространением тестов, которые позволяют для дальнейшего характеристика эффектора населения, участвующие в отказе кожи и противоопухолевого ответа.
Protocol
Discussion
Амфибии Xenopus является уникальным универсальным не-млекопитающих модель для изучения иммунитета. Его широко используют в биомедицинских и иммунологические исследования дали во многих важных исследовательских инструментов, таких как МНС определена клонов LG-6 и LG-15, а также различн…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Хозяйства эксперт животных при условии, Тина Мартин и Дэвид Олбрайт благодарностью оценили. Это исследование было поддержано грантами T32-AI-07285 (HN), NIH R25 2GM064133 (TCL), 1R03-HD061671-01, R24-AI-059830-06 от НИЗ.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Reagents needed: | ||||
| Amphibian Phosphate Buffered Saline (APBS): | ||||
| NaCl, 1.15 g/L | ||||
| Na2HPO4, 0.2 g/L | ||||
| KH2PO | ||||
| 10N NaOH | ||||
| Tricaine Methane Sulfonate (TMS, MS-222) | Crescent Research Chemicals | CAS#886-86-2 | ||
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S-233-500 | ||
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | 100ml | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | ||
| Culture medium for Xenopus 15/0 tumors [see 3 for more details]: | ||||
| Iscove DMEM basal medium | Gibco-Invitrogen | 11965 | ||
| Insulin | ||||
| Non-essential amino acids | ||||
| Penicillin-streptomycin | ||||
| Kanamycin | ||||
| Primatone | Sheffield Products Division | |||
| β2-mercaptoethanol | ||||
| NaHCO3 | ||||
| 30% double distilled water | ||||
| 5% featal bovine serum | ||||
| 20% superantant from a Xenopus kidney cell line A6 | ||||
| 0.25% of normal Xenopus serum | ||||
| Materials and Equipment: | ||||
| 50 and 15 ml conical centrifuge tubes (sterile) | ||||
| 25 gauge 5/8 Precision Glide sterile needles | BD | |||
| 18 gauge 1½ Precision Glide sterile needles | BD | |||
| 1 ml Tuberculin Slip Tip Syringe sterile | BD | |||
| 10 ml Slip Tip Syringe sterile | BD | |||
| 1.5 ml MicroCentrifuge tubes (sterile) | ||||
| 60 X 15 mm Polystyrene Petri Dishes sterile | Falcon | |||
| Razor blades | ||||
| 25 X 75 mm X 1 mm Premium Microscope Slides | Fisher Scientific | |||
| 10 cm glass petri dishes | ||||
| 9″ Pasteur Pipetes Durex Borosilicate Glass Cotton Plugged Disposable | VWR | |||
| Tygon tubing | ||||
| Two # 5 Swiss Jeweler’s Forceps | Miltex Inc. | |||
| Micro Dissecting Spring Scissors McPherson-Vannas straight cutting edge 6 mm | Roboz | |||
| Helios calipers | ||||
| Dissecting microscope | ||||
| High intensity illuminator | ||||
| Hemacytometer | ||||
| Un-bunsen burner | ||||
| 37°C shaking incubator | ||||
| Centrifuge |
References
- Kobel, H. R., Pasquier, D. u., L, . Hyperdiploid species hybrids for gene mapping in Xenopus. Nature. 279, 157-158 (1979).
- Robert, J., Menoret, A., Basu, S., Cohen, N., Srivastava, P. R. Phylogenetic conservation of the molecular and immunological properties of the chaperones gp96 and hsp70. Eur J Immunol. 31, 186-195 (2001).
- Robert, J., Gantress, J., Cohen, N., Maniero, G. D. Xenopus as an experimental model for studying evolution of hsp–immune system interactions. Methods. 32, 42-53 (2004).
- Chardonnens, X., Pasquier, D. u., L, . Induction of skin allograft tolerance during metamorphosis of the toad Xenopus laevis: a possible model for studying generation of self tolerance to histocompatibility antigens. Eur J Immunol. 3, 569-573 (1973).
- Du Pasquier, L., Bernard, C. C. Active suppression of the allogeneic histocompatibility reactions during the metamorphosis of the clawed toad Xenopus. Differentiation. 16, 1-7 (1980).
- Ramanayake, T., Simon, D. A., Frelinger, J. G., Lord, E. M., Robert, J. In vivo study of T-cell responses to skin alloantigens in Xenopus using a novel whole-mount immunohistology method. Transplantation. 83, 159-166 (2007).
- Robert, J., Ramanayake, T., Maniero, G. D., Morales, H., Chida, A. S., S, A. Phylogenetic conservation of glycoprotein 96 ability to interact with CD91 and facilitate antigen cross-presentation. J Immunol. 180, 3176-3182 (2008).
- Robert, J., Gantress, J., Rau, L., Bell, A., Cohen, N. Minor histocompatibility antigen-specific MHC-restricted CD8 T cell responses elicited by heat shock proteins. J Immunol. 168, 1697-1703 (2002).
- Morales, H., Robert, J. In vivo and in vitro techniques for comparative study of antiviral T-cell responses in the amphibian Xenopus. Biol Proced Online. 10, 1-8 (2008).
- Maniero, G. D., Robert, J. Phylogenetic conservation of gp96-mediated antigen-specific cellular immunity: new evidence from adoptive cell transfer in xenopus. Transplantation. 78, 1415-1421 (2004).
