Comparativo In vivo Estudo da gp96 adjuvante no Sapo Xenopus laevis</em
Summary
O sapo<em> Xenopus laevis</em> Oferece um atraente modelo de não-mamíferos alternativa para explorar a capacidade da proteína de choque térmico, tais como para promover a gp96 antígeno-específica de células T CD8 respostas. Nós apresentamos métodos para o estudo<em> In vivo</em> Facilitação de apresentação cruzada de antígenos de tumor de pele e gp96.
Abstract
Temos desenvolvido no Xenopus laevis anfíbios um modelo não-mamíferos única de estudar a capacidade das proteínas de choque térmico certos (HSPs) como gp96 para facilitar a apresentação cruzada de antígenos chaperoned e provocar inata e adaptativa respostas de células T. Xenopus rejeição do enxerto de pele fornece uma excelente plataforma para estudar a capacidade de gp96 para provocar clássicos MHC de classe Ia (classe IA) restringiu as respostas das células T. Além disso, o sistema modelo de Xenopus também oferece uma alternativa atraente aos ratos para explorar a capacidade de gerar respostas gp96 contra tumores que têm baixo-regulado suas moléculas de classe Ia escapando desta forma de vigilância imunológica. Recentemente, desenvolvemos um ensaio transferência adotiva de células em Xenopus clones usando leucócitos peritoneal como células apresentadoras de antígenos (APCs), e mostrou que pode gp96 prime T CD8 respostas de células in vivo contra antígenos de histocompatibilidade menores da pele, bem como contra o tumor do timo Xenopus 15 / 0 que não expressam moléculas Ia classe. Descrevemos aqui a metodologia envolvida para realizar essas análises, incluindo a transferência de elicitação pulsante, e adotivos de leucócitos peritoneal, bem como o enxerto de pele e ensaios transplante tumor. Além disso também estamos descrevendo a colheita e separação de leucócitos do sangue periférico utilizado para a citometria de fluxo e ensaios de proliferação que permitem uma melhor caracterização das populações efetoras envolvidas na rejeição da pele e anti-tumor respostas.
Protocol
Discussion
O anfíbio Xenopus é um exclusivo modelo de não-mamíferos versátil para estudar a imunidade. Sua ampla utilização na pesquisa biomédica e imunológicos rendeu em muitas ferramentas de pesquisa importantes, como os clones MHC definido LG-6 e LG-15, bem como linhas de células diferentes e anticorpos monoclonais. Usando essas ferramentas nós estabelecemos diferentes in vitro e em ensaios in vivo para estudar a capacidade das proteínas de choque térmico, como gp96 para mediar p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A criação de animais técnicos fornecidos pela Tina Martin e David Albright é apreciadas. Esta pesquisa foi suportada por concessões T32-AI-07285 (HN), NIH R25 2GM064133 (TCL), 1R03-HD061671-01, R24-AI-059830-06 do NIH.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Reagents needed: | ||||
| Amphibian Phosphate Buffered Saline (APBS): | ||||
| NaCl, 1.15 g/L | ||||
| Na2HPO4, 0.2 g/L | ||||
| KH2PO | ||||
| 10N NaOH | ||||
| Tricaine Methane Sulfonate (TMS, MS-222) | Crescent Research Chemicals | CAS#886-86-2 | ||
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S-233-500 | ||
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | 100ml | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | ||
| Culture medium for Xenopus 15/0 tumors [see 3 for more details]: | ||||
| Iscove DMEM basal medium | Gibco-Invitrogen | 11965 | ||
| Insulin | ||||
| Non-essential amino acids | ||||
| Penicillin-streptomycin | ||||
| Kanamycin | ||||
| Primatone | Sheffield Products Division | |||
| β2-mercaptoethanol | ||||
| NaHCO3 | ||||
| 30% double distilled water | ||||
| 5% featal bovine serum | ||||
| 20% superantant from a Xenopus kidney cell line A6 | ||||
| 0.25% of normal Xenopus serum | ||||
| Materials and Equipment: | ||||
| 50 and 15 ml conical centrifuge tubes (sterile) | ||||
| 25 gauge 5/8 Precision Glide sterile needles | BD | |||
| 18 gauge 1½ Precision Glide sterile needles | BD | |||
| 1 ml Tuberculin Slip Tip Syringe sterile | BD | |||
| 10 ml Slip Tip Syringe sterile | BD | |||
| 1.5 ml MicroCentrifuge tubes (sterile) | ||||
| 60 X 15 mm Polystyrene Petri Dishes sterile | Falcon | |||
| Razor blades | ||||
| 25 X 75 mm X 1 mm Premium Microscope Slides | Fisher Scientific | |||
| 10 cm glass petri dishes | ||||
| 9″ Pasteur Pipetes Durex Borosilicate Glass Cotton Plugged Disposable | VWR | |||
| Tygon tubing | ||||
| Two # 5 Swiss Jeweler’s Forceps | Miltex Inc. | |||
| Micro Dissecting Spring Scissors McPherson-Vannas straight cutting edge 6 mm | Roboz | |||
| Helios calipers | ||||
| Dissecting microscope | ||||
| High intensity illuminator | ||||
| Hemacytometer | ||||
| Un-bunsen burner | ||||
| 37°C shaking incubator | ||||
| Centrifuge |
References
- Kobel, H. R., Pasquier, D. u., L, . Hyperdiploid species hybrids for gene mapping in Xenopus. Nature. 279, 157-158 (1979).
- Robert, J., Menoret, A., Basu, S., Cohen, N., Srivastava, P. R. Phylogenetic conservation of the molecular and immunological properties of the chaperones gp96 and hsp70. Eur J Immunol. 31, 186-195 (2001).
- Robert, J., Gantress, J., Cohen, N., Maniero, G. D. Xenopus as an experimental model for studying evolution of hsp–immune system interactions. Methods. 32, 42-53 (2004).
- Chardonnens, X., Pasquier, D. u., L, . Induction of skin allograft tolerance during metamorphosis of the toad Xenopus laevis: a possible model for studying generation of self tolerance to histocompatibility antigens. Eur J Immunol. 3, 569-573 (1973).
- Du Pasquier, L., Bernard, C. C. Active suppression of the allogeneic histocompatibility reactions during the metamorphosis of the clawed toad Xenopus. Differentiation. 16, 1-7 (1980).
- Ramanayake, T., Simon, D. A., Frelinger, J. G., Lord, E. M., Robert, J. In vivo study of T-cell responses to skin alloantigens in Xenopus using a novel whole-mount immunohistology method. Transplantation. 83, 159-166 (2007).
- Robert, J., Ramanayake, T., Maniero, G. D., Morales, H., Chida, A. S., S, A. Phylogenetic conservation of glycoprotein 96 ability to interact with CD91 and facilitate antigen cross-presentation. J Immunol. 180, 3176-3182 (2008).
- Robert, J., Gantress, J., Rau, L., Bell, A., Cohen, N. Minor histocompatibility antigen-specific MHC-restricted CD8 T cell responses elicited by heat shock proteins. J Immunol. 168, 1697-1703 (2002).
- Morales, H., Robert, J. In vivo and in vitro techniques for comparative study of antiviral T-cell responses in the amphibian Xenopus. Biol Proced Online. 10, 1-8 (2008).
- Maniero, G. D., Robert, J. Phylogenetic conservation of gp96-mediated antigen-specific cellular immunity: new evidence from adoptive cell transfer in xenopus. Transplantation. 78, 1415-1421 (2004).
