Summary

Comparativo In vivo Studio di gp96 Adjuvanticity nella rana Xenopus laevis</em

Published: September 16, 2010
doi:

Summary

La rana<em> Xenopus laevis</em> Offre una interessante alternativa non-mammiferi modello per esplorare la possibilità di proteine ​​da shock termico come gp96 per promuovere antigene-specifiche risposte delle cellule T CD8. Vi presentiamo i metodi per lo studio<em> In vivo</emFacilitazione> di cross-presentazione di antigeni tumorali della pelle e da gp96.

Abstract

Abbiamo sviluppato negli anfibi Xenopus laevis un unico non-mammiferi modello per studiare la capacità di alcune proteine ​​da shock termico (HSP) come gp96 per facilitare la cross-presentazione di antigeni sorvegliati e suscitano innata e adattiva le risposte delle cellule T. Rigetto del trapianto pelle Xenopus fornisce una piattaforma eccellente per studiare la capacità di gp96 per suscitare classica MHC di classe Ia (classe Ia) limitato le risposte delle cellule T. Inoltre, il sistema Xenopus modello fornisce anche una valida alternativa al mouse per esplorare la capacità di gp96 di generare risposte contro i tumori che hanno down-regolato loro molecole di classe Ia fine di eludere la sorveglianza immunitaria. Recentemente, abbiamo sviluppato un saggio di trasferimento adottivo di cellule di cloni Xenopus utilizzando leucociti peritoneali come cellule presentanti l'antigene (APC), e dimostrato che la gp96 possibile preparare le risposte delle cellule T CD8 in vivo contro gli antigeni di istocompatibilità minori della pelle così come contro il tumore del timo Xenopus 15 / 0 che non esprime molecole di Ia classe. Descriviamo qui la metodologia coinvolti per eseguire questi test tra cui il trasferimento elicitazione, pulsante e adottivi dei leucociti peritoneali, così come l'innesto di pelle e saggi di trapianto di tumore. Inoltre siamo anche descrivendo la raccolta e la separazione dei leucociti del sangue periferico utilizzato per la citometria a flusso e saggi di proliferazione che consentono un'ulteriore caratterizzazione delle popolazioni effettrici coinvolte nel rifiuto della pelle e anti-tumore risposte.

Protocol

1. Animali X. laevis x X. Gilli ibridi LG-6 e LG-15 cloni isogenetic 1 sono dalla nostra colonia di riproduzione presso l'Università di Rochester (http://www.urmc.rochester.edu/smd/mbi/xenopus/index.htm). LG-6 e LG-15 condividono lo stesso aplotipo MHC eterozigote (a / c) ma si differenziano a minori di istocompatibilità (H) loci. Progenie di questi cloni sono prodotti da gynogenesis, in cui le uova diploidi prodotte dalla femmina sono attivati ​​da UV-ir…

Discussion

L'anfibio Xenopus è un unico versatile non mammiferi modello per studiare l'immunità. Il suo largo uso nella ricerca biomedica e immunologico ha prodotto in molti strumenti di ricerca importanti come i cloni MHC definito LG-6 e LG-15 così come diverse linee cellulari e anticorpi monoclonali. L'utilizzo di questi strumenti che abbiamo stabilito diversi in vitro e in vivo per studiare la capacità delle proteine ​​heat shock come gp96 di mediare potente Ag-specifici anti-minor…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La zootecnia esperto fornito da Tina Martin e David Albright è apprezzati. Questa ricerca è stata sostenuta da finanziamenti T32-AI-07285 (HN), NIH R25 2GM064133 (TCL), 1R03-HD061671-01, R24-AI-059830-06 dal NIH.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Reagents needed:        
Amphibian Phosphate Buffered Saline (APBS):        
NaCl, 1.15 g/L        
Na2HPO4, 0.2 g/L        
KH2PO        
10N NaOH        
Tricaine Methane Sulfonate (TMS, MS-222)   Crescent Research Chemicals CAS#886-86-2  
Sodium bicarbonate   Fisher Scientific S-233-500  
Histopaque-1077   Sigma-Aldrich 10771 100ml
Heparin Sodium Salt   Sigma-Aldrich H3149-50KU  
Culture medium for Xenopus 15/0 tumors [see 3 for more details]:        
Iscove DMEM basal medium   Gibco-Invitrogen 11965  
Insulin        
Non-essential amino acids        
Penicillin-streptomycin        
Kanamycin        
Primatone   Sheffield Products Division    
β2-mercaptoethanol        
NaHCO3        
30% double distilled water        
5% featal bovine serum        
20% superantant from a Xenopus kidney cell line A6        
0.25% of normal Xenopus serum        
Materials and Equipment:        
50 and 15 ml conical centrifuge tubes (sterile)        
25 gauge 5/8 Precision Glide sterile needles   BD    
18 gauge 1½ Precision Glide sterile needles   BD    
1 ml Tuberculin Slip Tip Syringe sterile   BD    
10 ml Slip Tip Syringe sterile   BD    
1.5 ml MicroCentrifuge tubes (sterile)        
60 X 15 mm Polystyrene Petri Dishes sterile   Falcon    
Razor blades        
25 X 75 mm X 1 mm Premium Microscope Slides   Fisher Scientific    
10 cm glass petri dishes        
9″ Pasteur Pipetes Durex Borosilicate Glass Cotton Plugged Disposable   VWR    
Tygon tubing        
Two # 5 Swiss Jeweler’s Forceps   Miltex Inc.    
Micro Dissecting Spring Scissors McPherson-Vannas straight cutting edge 6 mm   Roboz    
Helios calipers        
Dissecting microscope        
High intensity illuminator        
Hemacytometer        
Un-bunsen burner        
37°C shaking incubator        
Centrifuge        

References

  1. Kobel, H. R., Pasquier, D. u., L, . Hyperdiploid species hybrids for gene mapping in Xenopus. Nature. 279, 157-158 (1979).
  2. Robert, J., Menoret, A., Basu, S., Cohen, N., Srivastava, P. R. Phylogenetic conservation of the molecular and immunological properties of the chaperones gp96 and hsp70. Eur J Immunol. 31, 186-195 (2001).
  3. Robert, J., Gantress, J., Cohen, N., Maniero, G. D. Xenopus as an experimental model for studying evolution of hsp–immune system interactions. Methods. 32, 42-53 (2004).
  4. Chardonnens, X., Pasquier, D. u., L, . Induction of skin allograft tolerance during metamorphosis of the toad Xenopus laevis: a possible model for studying generation of self tolerance to histocompatibility antigens. Eur J Immunol. 3, 569-573 (1973).
  5. Du Pasquier, L., Bernard, C. C. Active suppression of the allogeneic histocompatibility reactions during the metamorphosis of the clawed toad Xenopus. Differentiation. 16, 1-7 (1980).
  6. Ramanayake, T., Simon, D. A., Frelinger, J. G., Lord, E. M., Robert, J. In vivo study of T-cell responses to skin alloantigens in Xenopus using a novel whole-mount immunohistology method. Transplantation. 83, 159-166 (2007).
  7. Robert, J., Ramanayake, T., Maniero, G. D., Morales, H., Chida, A. S., S, A. Phylogenetic conservation of glycoprotein 96 ability to interact with CD91 and facilitate antigen cross-presentation. J Immunol. 180, 3176-3182 (2008).
  8. Robert, J., Gantress, J., Rau, L., Bell, A., Cohen, N. Minor histocompatibility antigen-specific MHC-restricted CD8 T cell responses elicited by heat shock proteins. J Immunol. 168, 1697-1703 (2002).
  9. Morales, H., Robert, J. In vivo and in vitro techniques for comparative study of antiviral T-cell responses in the amphibian Xenopus. Biol Proced Online. 10, 1-8 (2008).
  10. Maniero, G. D., Robert, J. Phylogenetic conservation of gp96-mediated antigen-specific cellular immunity: new evidence from adoptive cell transfer in xenopus. Transplantation. 78, 1415-1421 (2004).

Play Video

Cite This Article
Nedelkovska, H., Cruz-Luna, T., McPherson, P., Robert, J. Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (43), e2026, doi:10.3791/2026 (2010).

View Video