Embriyo sırasında Fonksiyonel Artıklık Test Ters Genetik Yaklaşım
Summary
Gen fonksiyonu, başka bir gen tarafından tazminat varsa, fonksiyon kaybı-deneylerde gizlenmiş olabilir. Zebrafish modeli canlı embriyolarının gibi fonksiyonel fazlalık ortaya çıkarmak için nispeten yüksek bir verimlilik anlamına gelir sağlar.
Abstract
Embriyogenez sırasında Gen fonksiyonu genellikle fare hedef mutagenez (nakavt), örneğin, fonksiyon kaybı-deneyleri ile tanımlanır. Zebra balığı modeli gen-spesifik antisens morpholinos mikroenjeksiyon kullanarak, etkili ters genetik teknikler geliştirilmiştir. Morpholinos embriyogenez (demonte) inhibe çeviri sırasında birkaç gün ya da ekleme, geçici olarak belirli bir baz eşleşme ve blok gen fonksiyonu ile bir mRNA'nın hedef. Ancak, fare ya da Zebra balığı gibi omurgalıların, bazı genlerin fonksiyonlarının kaybı telafi başka bir genin varlığı nedeniyle bu yaklaşımlar tarafından gizlenmiş olabilir. Bu, aynı gelişmekte olan dokularda ifade edilir kızkardeşi genleri içeren gen aileler için özellikle doğrudur. Zebra balığı, fonksiyonel tazminat morpholinos co-enjeksiyon, nispeten yüksek verimli bir şekilde test edilebilir, bu genlerin aynı anda hedef demonte. Aynı şekilde, morpholinos kullanarak, herhangi iki gen arasındaki genetik bir etkileşim alt-eşik seviyelerinde birlikte, hem genler demonte tarafından ortaya olabilir. Örneğin, morpholinos ne bireysel demonte bir fenotip oluşturduğu gibi titre edilebilir. Bu koşullar altında, hem de morpholinos ko-enjeksiyon bir fenotipe neden varsa, genetik bir etkileşim göstermiştir. Burada birbiriyle ilişkili iki GATA transkripsiyon faktörleri bağlamında nasıl göstermek için fonksiyonel fazlalık göstermektedir. GATA faktörler kalp atalarıdır tanımlanması için gerekli olan, ancak bu sadece Gata5 ve Gata6 kaybı ortaya çıkar. Biz, mikroenjeksiyon deneyleri yürütmek, morpholinos doğrulamak ve cardiogenesis için telafi fenotip değerlendirmek nasıl göstermektedir.
Protocol
Discussion
Burada anlatılan deney, tek başına ayrı bir fenotip yelpazesi olan her iki morpholinos, kombine ve birlikte ortak enjekte edildi tamamen farklı bir fenotip bulundu. Tabii ki, ilk etapta bu denemeyi yapmak için bir gerekçe gerekiyordu. Biz iki genin, bu durumda kalp şartnamede, bir önceki fonksiyonu için birbirlerini telafi olabilir şüpheli. Bu genler çok ilgili (ve aynı DNA dizilerinin bağlama yeteneğine) ve embriyogenez 5 sırasında desen örtüşen ifade edilir çünkü. Ayrıca, Drosop…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz bu sunum hazırlama, yardım ettikleri için Evans laboratuvar üyeleri teşekkür ediyorum. Burada kullanılan morpholinos başlangıçta Dr. Audrey Holtzinger tarafından onaylandı. TE, Ulusal Sağlık Enstitüleri (HL064282 ve HL056182) hibe tarafından desteklenmektedir. Weill Cornell Medical College Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu Enstitüsü tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fish breeder tanks and dividers | Aquatic Habitats | |||
| Fish nets | Aquatic Habitats | |||
| System water | 60mg “Instant Ocean” per liter dH2O | |||
| 100mm Petri dishes | BD Falcon | 351029 | ||
| Micropipette needle puller | Sutter instruments, Co. | P-97 Flaming/Brown | ||
| 3.5″ glass capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | ||
| Razor blade | Personna | 94-120-71 | ||
| Micro grinder | Narishige, Japan | EG-4 | ||
| Gridded microscope eyepiece | Premiere | MF-02 | ||
| Micrometer | Ward’s Natural Science | 94 W 9910 | ||
| Ultrapure agarose | Invitrogen | 15510-027 | ||
| Spatula | Fisher | 14-357Q | ||
| Scale | Mettler Toledo | AB54-S/FACT | ||
| Disposable weigh dishes | Fisher | 2-202-B | ||
| Conventional microwave | General Electric | |||
| Erlenmeyer flask | Corning | 4980 | ||
| Microscope slides | Fisher | 12-552 | ||
| Graduated cylinder | Fisher | 08-572-6D | ||
| Automatic pipette man | BrandTech | 2026333 | ||
| 70% ethanol wash solution | Tarr | 801VWR | ||
| N2 tank | Tech Air | |||
| Microinjector | Harvard apparatus | PLI-100 | ||
| Micromanipulator | Micro Instruments | LTD | ||
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ1500 | ||
| Parafilm | American National Can | PM-992 | ||
| Mineral oil | Sigma | M5904 | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | ||
| gata5 splice site morpholino | Genetools, LLC | 5′-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3′ | ||
| gata5 ATG Blocker | Genetools, LLC | 5′-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3′ | ||
| gata6 Long Isoform ATG Blocker | Genetools, LLC | 5′-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3′ | ||
| Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-20B | ||
| Tricaine Methanesulfonate | Argent Chemical Laboratories | MS-222 | ||
| Methycellulose | ICN Biomedicals | 155495 | ||
| Heat Block | Fisher | 11-718-4 | ||
| Sharp forceps | Dumont | Size 55 | ||
| Depression Microslides | VWR | 48339-009 |
References
- Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
- Holtzinger, A., Evans, T. Gata5 and Gata6 are functionally redundant in zebrafish for specification of cardiomyocytes. Dev Biol. 312, 613-622 (2007).
- Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium. Dev Biol. 311, 623-635 (2007).
- Holtzinger, A., Evans, T. Gata4 regulates the formation of multiple organs. Development. 132, 4005-4014 (2005).
- Sorrentino, R. P., Gajewski, K. M., Schulz, R. A. GATA factors in Drosophila heart and blood cell development. Semin Cell Dev Biol. 16, 107-116 (2005).
