نهج عكس الوراثية لاختبار التكرار وظيفية خلال مرحلة التطور الجنيني
Summary
ويمكن أن تحجب وظيفة الجين في خسارة وظيفة من التجارب اذا كان هناك تعويض آخر الجينات. نموذج الزرد يوفر نسبيا عالية الإنتاجية وسائل للكشف عن التكرار وظيفية من هذا القبيل في الأجنة الحية.
Abstract
عادة ما يتم تعريف وظيفة الجين خلال مرحلة التطور الجنيني من فقدان وظيفة ، من التجارب ، على سبيل المثال عن طريق الطفرات المستهدفة (خروج المغلوب) في الماوس. في النموذج الزرد ، وقد وضعت التقنيات الجينية العكسية الفعالة باستخدام microinjection من العقاقير morpholinos الجينات المحددة. Morpholinos استهداف مرنا من خلال المزاوجة قاعدة محددة وظيفة الجين كتلة عابر عن طريق الترجمة أو تثبيط الربط لعدة أيام خلال مرحلة التطور الجنيني (ضربة قاضية). ومع ذلك ، في الفقاريات مثل الماوس أو الزرد ، ويمكن حجب بعض وظائف الجينات بواسطة هذه الأساليب بسبب وجود جين آخر أن يعوض عن الخسارة. هذا صحيح خصوصا بالنسبة للأسر تحتوي على جينات المورثات الشقيقة التي شاركت في وأعرب في نفس الأنسجة النامية. في الزرد ، ويمكن اختبارها التعويض وظيفية بطريقة الإنتاجية العالية نسبيا ، عن طريق الحقن المشترك للmorpholinos أن الهدف ضربة قاضية لكل من الجينات في وقت واحد. وبالمثل ، وذلك باستخدام morpholinos ، يمكن أن يكون أظهر تفاعل الجينات الوراثية بين أي اثنين من ضربة قاضية لكل من الجينات معا في شبه عتبة المستويات. على سبيل المثال ، يمكن معاير morpholinos بحيث لا ضربة قاضية فرد يولد النمط الظاهري. إذا ، في ظل هذه الظروف ، وشارك في كل من الحقن morpholinos يسبب النمط الظاهري ، يظهر التفاعل الجيني. نحن هنا لشرح كيفية اظهار التكرار وظيفية في سياق اثنين من العوامل المتصلة النسخ غاتا. غاتا عوامل ضرورية لتحديد الأسلاف القلب ، ولكن كشف هذا فقط بسبب فقدان كل من Gata5 وGata6. نعرض كيفية اجراء تجارب microinjection ، التحقق من صحة morpholinos ، وتقييم التعويض عن النمط الظاهري تخلق القلب.
Protocol
Discussion
كنا معا في التجربة الموصوفة هنا ، وهما morpholinos ، كل وحدها التي تولد مجموعة متميزة من الظواهر ، والعثور على النمط الظاهري مختلفة تماما عندما كانت تشارك في حقن معا. بالطبع ، نحن في حاجة لتبرير القيام بهذه التجربة في المقام الأول. نحن يشتبه بأن الجينين قد تعوض بعضها البعض ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أعضاء المختبر ايفانز لمساعدتهم في إعداد هذا العرض. تم التحقق من سلامة الأصل morpholinos المستخدمة هنا الدكتور أودري Holtzinger. وتدعم الشركة المصرية للاتصالات عن طريق المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (وHL064282 HL056182). وقد أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعها المعهد لرعاية الحيوان واستخدام اللجنة ، من كلية طب وايل كورنيل.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fish breeder tanks and dividers | Aquatic Habitats | |||
| Fish nets | Aquatic Habitats | |||
| System water | 60mg “Instant Ocean” per liter dH2O | |||
| 100mm Petri dishes | BD Falcon | 351029 | ||
| Micropipette needle puller | Sutter instruments, Co. | P-97 Flaming/Brown | ||
| 3.5″ glass capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | ||
| Razor blade | Personna | 94-120-71 | ||
| Micro grinder | Narishige, Japan | EG-4 | ||
| Gridded microscope eyepiece | Premiere | MF-02 | ||
| Micrometer | Ward’s Natural Science | 94 W 9910 | ||
| Ultrapure agarose | Invitrogen | 15510-027 | ||
| Spatula | Fisher | 14-357Q | ||
| Scale | Mettler Toledo | AB54-S/FACT | ||
| Disposable weigh dishes | Fisher | 2-202-B | ||
| Conventional microwave | General Electric | |||
| Erlenmeyer flask | Corning | 4980 | ||
| Microscope slides | Fisher | 12-552 | ||
| Graduated cylinder | Fisher | 08-572-6D | ||
| Automatic pipette man | BrandTech | 2026333 | ||
| 70% ethanol wash solution | Tarr | 801VWR | ||
| N2 tank | Tech Air | |||
| Microinjector | Harvard apparatus | PLI-100 | ||
| Micromanipulator | Micro Instruments | LTD | ||
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ1500 | ||
| Parafilm | American National Can | PM-992 | ||
| Mineral oil | Sigma | M5904 | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | ||
| gata5 splice site morpholino | Genetools, LLC | 5′-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3′ | ||
| gata5 ATG Blocker | Genetools, LLC | 5′-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3′ | ||
| gata6 Long Isoform ATG Blocker | Genetools, LLC | 5′-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3′ | ||
| Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-20B | ||
| Tricaine Methanesulfonate | Argent Chemical Laboratories | MS-222 | ||
| Methycellulose | ICN Biomedicals | 155495 | ||
| Heat Block | Fisher | 11-718-4 | ||
| Sharp forceps | Dumont | Size 55 | ||
| Depression Microslides | VWR | 48339-009 |
References
- Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
- Holtzinger, A., Evans, T. Gata5 and Gata6 are functionally redundant in zebrafish for specification of cardiomyocytes. Dev Biol. 312, 613-622 (2007).
- Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium. Dev Biol. 311, 623-635 (2007).
- Holtzinger, A., Evans, T. Gata4 regulates the formation of multiple organs. Development. 132, 4005-4014 (2005).
- Sorrentino, R. P., Gajewski, K. M., Schulz, R. A. GATA factors in Drosophila heart and blood cell development. Semin Cell Dev Biol. 16, 107-116 (2005).
