Gene-Funktion kann in loss-of-function Experimente verdeckt werden, wenn es eine Kompensation durch ein anderes Gen. Der Zebrafisch-Modell bietet eine relativ hohem Durchsatz, um eine solche funktionelle Redundanz in lebenden Embryonen zu offenbaren.
Gene-Funktion während der Embryogenese wird typischerweise durch loss-of-function Experimente definiert, zum Beispiel durch gezielte Mutagenese (KO) in der Maus. In der Zebrafisch-Modell, über wirksame reverse genetische Techniken entwickelt, mit Mikroinjektion von Gen-spezifischen Antisense Morpholinos. Morpholinos Ziel einer mRNA durch spezifische Basenpaarung und Block Genfunktion vorübergehend durch die Hemmung der Translation oder Spleißen für mehrere Tage während der Embryogenese (Zuschlag). Doch bei Wirbeltieren wie Maus oder Zebrafisch, können einige Funktionen von Genen durch diese Ansätze durch die Anwesenheit eines anderen Gens, das für den Verlust entschädigt verdeckt werden. Dies gilt insbesondere für die Gen-Familien, die Schwester Gene, die in der gleichen entwickelnde Gewebe co-exprimiert. In Zebrafisch können funktionelle Kompensation in einem relativ hohen Durchsatz Weise getestet werden, durch Co-Injektion von Morpholinos dieses Ziel Knockdown von beiden Genen gleichzeitig. Ebenso mit Morpholinos, kann eine genetische Interaktion zwischen zwei Genen, die durch Knockdown beider Gene demonstriert zusammen mit sub-Schwellenwerte. Zum Beispiel kann Morpholinos titriert, so dass weder einzelne Knockdown einen Phänotyp erzeugt werden. Wenn unter diesen Bedingungen, Ursachen Co-Injektion von sowohl Morpholinos einem Phänotyp, ist eine genetische Interaktion gezeigt. Hier zeigen wir, wie man funktionale Redundanz im Rahmen von zwei verwandten GATA-Transkriptionsfaktoren zeigen. GATA Faktoren sind für die Spezifikation von kardialen Vorläuferzellen notwendig, aber dies ist nur durch den Verlust der beiden Gata5 und Gata6 enthüllt. Wir zeigen, wie die Durchführung Mikroinjektion Experimente bestätigen die Morpholinos, und bewerten die ausgeglichen Phänotyp für Kardiogenese.
In dem hier beschriebenen Experiment, kombiniert man zwei Morpholinos, von denen jeder allein erzeugen eine deutliche Reihe von Phänotypen, und fand eine ganz andere Phänotyp, wenn sie co-injiziert zusammen. Natürlich benötigten wir eine Rechtfertigung dafür dieses Experiment in den ersten Platz. Wir vermuteten, dass die beiden Gene könnten sich gegenseitig für eine frühere Funktion zu kompensieren, in diesem Fall kardiale Spezifikation. Dies liegt daran, die Gene sehr verwandt sind (und in der Lage die Bindung …
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Mitglieder der Evans-Labor für ihre Hilfe bei der Vorbereitung dieser Präsentation. Die hier verwendeten Morpholinos wurden ursprünglich von Dr. Audrey Holtzinger validiert. TE wird durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health (HL064282 und HL056182) unterstützt. Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch das Institute for Animal Care und Verwenden eingesetzten Ausschusses, des Weill Cornell Medical College durchgeführt.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Fish breeder tanks and dividers | Aquatic Habitats | |||
Fish nets | Aquatic Habitats | |||
System water | 60mg “Instant Ocean” per liter dH2O | |||
100mm Petri dishes | BD Falcon | 351029 | ||
Micropipette needle puller | Sutter instruments, Co. | P-97 Flaming/Brown | ||
3.5″ glass capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | ||
Razor blade | Personna | 94-120-71 | ||
Micro grinder | Narishige, Japan | EG-4 | ||
Gridded microscope eyepiece | Premiere | MF-02 | ||
Micrometer | Ward’s Natural Science | 94 W 9910 | ||
Ultrapure agarose | Invitrogen | 15510-027 | ||
Spatula | Fisher | 14-357Q | ||
Scale | Mettler Toledo | AB54-S/FACT | ||
Disposable weigh dishes | Fisher | 2-202-B | ||
Conventional microwave | General Electric | |||
Erlenmeyer flask | Corning | 4980 | ||
Microscope slides | Fisher | 12-552 | ||
Graduated cylinder | Fisher | 08-572-6D | ||
Automatic pipette man | BrandTech | 2026333 | ||
70% ethanol wash solution | Tarr | 801VWR | ||
N2 tank | Tech Air | |||
Microinjector | Harvard apparatus | PLI-100 | ||
Micromanipulator | Micro Instruments | LTD | ||
Dissecting microscope | Nikon | SMZ1500 | ||
Parafilm | American National Can | PM-992 | ||
Mineral oil | Sigma | M5904 | ||
Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | ||
gata5 splice site morpholino | Genetools, LLC | 5′-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3′ | ||
gata5 ATG Blocker | Genetools, LLC | 5′-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3′ | ||
gata6 Long Isoform ATG Blocker | Genetools, LLC | 5′-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3′ | ||
Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-20B | ||
Tricaine Methanesulfonate | Argent Chemical Laboratories | MS-222 | ||
Methycellulose | ICN Biomedicals | 155495 | ||
Heat Block | Fisher | 11-718-4 | ||
Sharp forceps | Dumont | Size 55 | ||
Depression Microslides | VWR | 48339-009 |