Gözlem ve ölçümü için bir tek tabaka hücreleri oluşturmak için bir self-made sitospin cihazların kullanımı dayalı, insan pluripotent kök hücreleri hücre yüzey belirteçleri için Süspansiyon immünositokimyasal boyama (hPSCs) (SSEA-3/SSEA-4) elde edildi.
Abstract
Insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve insan kaynaklı pluripotent kök hücreleri (hiPSCs) İnsan pluripotent kök hücreleri (hPSCs) sınırsız kendini yenileme yetenekleri ve çok sayıda hücre tipleri ayırt etmek için potansiyel nedeniyle heyecan verici hücre kaynaklarıdır. HPSCs pluripotent devlet qPCR, immünsitokimya gibi teknikler genellikle değerlendirilen ve diğer<em> In vitro</em> Ve<em> In vivo</em> Birden çok hücre tiplerine farklılaşma stratejileri. Bunlar arasında, immünositokimyasal teknikleri aday hücre içi ve hücre yüzeyi biyobelirteçleri analizine dayalı hPSCs farklılaşmamış devletin rutin karakterizasyonu için geliştirilmiştir. Koloniler, sorunları rutin olarak tek tek hücre düzeyinde bu belirteçlerin ifade nicel olarak ortaya çıkan hPSCs büyüdüğünü göz önüne alındığında. Flow sitometri analizleri, bu sorunu ancak hücre sayıları ve normal, hPSC kültürlerin rutin kalite kontrol değerlendirmesi için elverişli değildir reaktifler kullanımı için hizmet vermektedir. Böylece, belirteç değerlendirilmesi için bütünlüğü korunmuş tek tabaka hücre örnekleri oluşturmak pratik ve tekrarlanabilir araçlarının geliştirilmesi, kök hücre araştırmaları pek çok avantajı vardır. Tek tek hücrelerin tek tabaka kolayca gözlenir ve spesifik belirteçler ifade için nicel olabilir, çünkü bu, immünositokimyasal analiz büyük ölçüde yarar sağlar. Bu hedefe doğru, self-made sitospin aparat inşa edildi ve immünositokimyasal boyama ile kullanım için optimize edilmiş. İki hücre yüzey belirteçleri (SSEA3/SSEA4) ifadesi için bir varyantı BG01 Bu protokolün amacı, kök hücre hattı analiz edildi.
Protocol
Bölüm 1: Süspansiyon İmmünositokimyasal Boyama Hücreler tek bir hücre süspansiyonu hasat edilir. Bu hücreler daha sonra 1.5 2mL mikrosantrifüj tüpler aktarılır ve 200g 4 dakika santrifüj. Hücreler supernatant dışarı aspire tarafından yıkanır, PBS 1mL yeniden askıya – (Mg 2 olmadan + ve Ca 2 +) ve sonra 4 dakika için 200 gr tekrar santrifüj. Bu iki kez yapılmalıdır. Yıkadıktan sonra, hücreler daha sonra yeniden askıya…
Discussion
Laboratuvar amaçları için, 35mm, fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) yetişen kök hücre kültürleri bir çanak immünositokimyasal boyama prosedürü için sitospin aparatı ile kullanım için ayrılmıştır. Hücreler daha sonra bir tek hücre süspansiyonu, MEF katmanı mümkün olduğu kadar çok kaldırarak, Pasajlanması enzimatik yoluyla tahsil edilir. MEF katman daha etkili kök hücre izolasyonu isteniyorsa, koloniler elle süspansiyon içine sindirilmiş sonra aldı olabilir. Besleyici ücretsiz koşul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NSF KARİYER 0744556 (Rao) ve VCU HHMI Bilim Eğitim ve Araştırma Programı (Pascual) aracılığıyla burs tarafından bu iş için kısmi finansman sağlandı.
Pascual, E. Y., Riggs, M. J., Rao, R. R. Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus. J. Vis. Exp. (38), e1944, doi:10.3791/1944 (2010).