Suspension immunzytochemische Färbung von menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) für Zell-Oberflächen-Marker (SSEA-3/SSEA-4) wurde basierend auf der Verwendung einer self-made Zytospin Apparat zu einer Monoschicht von Zellen für die Beobachtung und Quantifizierung erstellen erreicht.
Abstract
Menschliche pluripotente Stammzellen (hPSCs), dass menschliche embryonale Stammzellen (hES) und der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) enthalten, werden spannende Zellquellen aufgrund ihrer grenzenlosen Selbst-Erneuerung Fähigkeiten und ihr Potenzial, in verschiedenen Zelltypen zu differenzieren. Die pluripotenten Zustand hPSCs ist in der Regel durch Techniken wie qPCR, Immunzytochemie beurteilt und von anderen<em> In-vitro-</em> Und<em> In vivo</em> Differenzierung Strategien in verschiedenen Zelltypen. Unter diesen haben immunzytochemische Techniken zur Routine Charakterisierung der undifferenzierten Zustand der hPSCs auf der Analyse der Kandidat intra-und Zell-Oberflächen-Biomarkern entwickelt worden. Angesichts der Tatsache, dass hPSCs als Kolonien, Probleme bei der Quantifizierung der Expression dieser Marker an den einzelnen Zell-Ebene auf einer routinemäßigen entstehen wachsen. Durchflusszytometrie-Analysen dienen dazu, dieses Problem zu lösen, sondern bedürfen Zellzahlen und die Verwendung von Reagenzien, die normalerweise nicht förderlich für die routinemäßige Qualitätskontrolle Beurteilung HPSC Kulturen. So hat die Entwicklung von praktischen und reproduzierbare Mittel zur Schaffung von Monolayer Zellproben mit erhaltener Integrität für Marker Auswertung viele Vorteile in der Stammzellforschung. Diese großen Nutzen immunzytochemische Analyse, weil einzelne Zellen aus dem Monolayer leicht beobachtet werden können und quantifiziert für die Expression spezifischer Marker. Mit diesem Ziel wurde ein self-made Zytospin Apparat konstruiert und optimiert für den Einsatz mit immunzytochemische Färbung. Zwei Zelloberflächen-Marker (SSEA3/SSEA4) Expression wurden in einer Variante BG01 Stammzell-Linie für die Zwecke dieses Protokolls analysiert.
Protocol
Teil 1: Die Aussetzung immunzytochemische Färbung Die Zellen werden in einer einzigen Zellsuspension geerntet. Die Zellen werden dann in 1,5-2ml Reaktionsgefäße überführt und zentrifugiert bei 200g für 4 Minuten. Die Zellen werden durch Absaugen aus Überstand gewaschen, in 1 ml PBS resuspendiert – (ohne Mg 2 + und Ca 2 +) und dann wieder bei 200g für 4 Minuten zentrifugiert. Dies sollte zweimal durchgeführt werden. Nach dem Waschen werden die Zellen…
Discussion
Für die Zwecke unseres Labors, ist ein 35-mm-Schale von Stammzell-Kulturen auf embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) gewachsen für die immunzytochemische Färbung Verfahren für den Einsatz mit dem Zytospin Apparat zugeteilt. Die Zellen werden dann mit Hilfe von enzymatischen Passagieren gesammelt, die Beseitigung so viel von der MEF-Schicht wie möglich, in einen Ein-Zell-Suspension. Wenn effektiver Stammzellen isoliert von der MEF-Schicht gewünscht wird, kann Kolonien manuell kommissioniert dann verdaut in Suspensio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Teilfinanzierung für diese Arbeit wurde von der NSF-CAREER 0744556 (Rao) und ein Stipendium durch die VCU-HHMI Science Education und Research Program (Pascual) zur Verfügung gestellt.
Pascual, E. Y., Riggs, M. J., Rao, R. R. Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus. J. Vis. Exp. (38), e1944, doi:10.3791/1944 (2010).