Embriyonik Spinal Commissural Aksonlar yönünü difüze Sinyal Molekülleri yeteneği Assaying
Summary
Bu testte commissural aksonların yeniden yönlendirmek için bir sinyal molekülü yeteneği, burada kemik morfogenetik protein 7 (BMP7) değerlendirir. Embriyonik dorsal spinal kord bir eksplant COS hücreleri salgılayan aday büyüme faktörleri toplu bir komşu kültür. Eksplant içinde büyüyen Nokia'nın commissural aksonlar immünohistokimya ile görüntülendi.
Abstract
Omurgalı omurilik 1 Dorsal commissural aksonlar aksona yol sinyalleri tanımlamak için paha biçilmez bir model sistem var. Burada, in vitro testi commissural aksonlar yönünü 2 dışsal ve içsel sinyalleri etkisini araştırmak için yaygın olarak kullanılan "yeniden yönlendirilmesi assay" açıklar. Bu testte, BMP, chemorepellent dahil olmak üzere, çok sayıda kişi tarafından Jane Dodd, Thomas Jessell ve Andrew Lumsden laboratuarlarında geliştirilen (Daha fazla bilgi için teşekkürler) ve bu testte sürümlerini anahtar akson rehberlik molekülleri yeniden yönlendirilmesi faaliyetleri göstermek için kullanılan 3,4 ve Netrin1 5 ve Sonic Hedgehog (Shh) omurilik zemin plakasını 6 chemoattractive faaliyetleri çatı plakası.
Eksplantlarındaki 2-3 segmentlerinde omurilik dorsal üçte ikisini oluşturan embriyonik gün (E) 11 sıçan disseke ve üç boyutlu kolajen jeller 7 olarak kültür. E11 dorsal spinal eksplantlar glikoprotein, tag1 8 aksonal ifade tarafından tespit edilebilir, yeni doğan commissural nöronlar, içerir . Commissural akson yörünge kültür 30-40 saat boyunca, in vivo olarak görülen benzer bir ders ile bu sırt eksplantlar değinmeyecek. Bu aksonal yörünge test dokuları ya da dorsal eksplant lateral kenarlarından biri ile temas aday sinyalleme molekülü ifade eden bir COS hücre agrega ya koyarak itiraz edilebilir. Eklenen doku çevresinde uzanan Commissural aksonlar endojen çatı plaka ve ektopik lateral doku sinyalleri hem de etkisi altında büyüyecek. Bu koşullar altında commissural aksonlar Nokia'nın derecesi belirlenebilir. Bu testte kullanarak, hem de belirli bir sinyal commissural yörünge 9 doğrudan bu sinyal gerekliliği sıra commissural aksonlar 3,4 reorient yeterliliğini incelemek mümkündür.
Protocol
Discussion
Bu testte gerçekleştirme başarısını belirlemek kritik faktörler, doku, çok uzun süre bir süre için dispase ile tedavi edilmesi gerektiğini, bu tedavi çok yapışkan hale doku ve canlılığı azalmış olan yol açacaktır. İki, kollajen mükemmel astar ve mümkün olduğu kadar buz üzerinde muhafaza edilmelidir. Ayarlamaya başlıyor işlemek için giderek daha zor olacak, yani pembe. Üç, tungsten iğne her zaman çok keskin tutulması gerekir.
Acknowledgements
Bu protokol, Jane Dodd, Thomas Jessell ve Andrew Lumsden laboratuvarlarında geliştirildi. Kollajen omurilik kültürü eksplantlar Konrad Basler, Ann Calof Thomas Edlund, Phil Hamilton, Domna Karagogeos, Ariel Ruiz i Altaba ve Toshiya Yamada da dahil olmak üzere birçok kişi belirlendi. Marysia Placzek ve Marc Tessier-Lavigne akson rehberliği moleküllerinin belirlenmesi için bir araç olarak in vitro eksplantlar akson büyüme kullanarak tekniğinin öncülüğünü yaptı. Butler, laboratuvar İş NIH / NINDS Dimes ve R01 NS063999 Mart hibe tarafından desteklenmektedir.
References
- Altman, J., Bayer, S. A. . The development of the rat spinal cord. , (1984).
- Placzek, M. Tissue recombinations in collagen gels. Methods in molecular biology. , 325-335 (2008).
- Augsburger, A., Schuchardt, A. BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons. Neuron. 24, 127-141 (1999).
- Butler, S. J., Dodd, J. A role for BMP heterodimers in roof plate-mediated repulsion of commissural axons. Neuron. 38, 389-401 (2003).
- Kennedy, T. E., Serafini, T. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78, 425-435 (1994).
- Charron, F., Stein, E. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. 113, 11-23 (2003).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323, 538-539 (1986).
- Dodd, J., Morton, S. B. Spatial regulation of axonal glycoprotein expression on subsets of embryonic spinal neurons. Neuron. 1, 105-116 (1988).
- Yamauchi, K., Phan, K. D., Butler, S. J. BMP type I receptor complexes have distinct activities mediating cell fate and axon guidance decisions. Development. 135, 1119-1128 (2008).
