Capacità di analizzare il diffusibili molecole di segnalazione per l'orientamento embrionali assoni spinali commissurali
Summary
Questo test valuta la capacità di una molecola di segnalazione, qui proteina morfogenetica dell'osso 7 (BMP7), di riorientare gli assoni commissurali. Un espianto di midollo embrionale dorsale spinale è colta adiacente a un aggregato di cellule secernenti COS i fattori di crescita candidato. Riorientato assoni commissurali crescita all'interno del espianto sono visualizzati mediante immunoistochimica.
Abstract
Dorsale commissurali assoni nel midollo spinale dei vertebrati 1 sono stati di un sistema prezioso modello in cui identificare i segnali di guida degli assoni. Qui, descriviamo un test in vitro ", il saggio riorientamento", che è stato ampiamente utilizzato per studiare l'effetto dei segnali estrinseci ed intrinseci sull'orientamento degli assoni commissurali 2. Questo test è stato sviluppato da numerose persone nei laboratori di Jane Dodd, Thomas Jessell e Andrew Lumsden (si vedano i ringraziamenti per maggiori dettagli) e le versioni di questo test sono stati utilizzati per dimostrare l'attività di riorientamento delle molecole chiave di guida degli assoni, tra cui il chemorepellent in BMP tetto piatto 3,4 e le attività di chemoattractive Netrin1 5 e Sonic hedgehog (Shh) 6 in la lastra di fondo nel midollo spinale.
Espianti composto da 2-3 segmenti della dorsale due terzi del midollo spinale vengono sezionati fin dal primo giorno embrionale (E) 11 ratti e coltivate in tre gel collagene dimensionale 7. E11 espianti dorsale spinale contengono neonata commissurali neuroni, che possono essere identificati dal loro espressione della glicoproteina assonale, Tag1 8. Nel corso di 30-40 ore nella cultura, la traiettoria assone commissurali è riassunta in queste espianti dorsale con un decorso simile a quello visto in vivo. Questa traiettoria assonale può essere contestata o posizionando i tessuti di prova o un aggregato di cellule COS esprimono una molecola di segnalazione candidato in contatto con uno dei bordi laterali del espianto dorsale. Assoni commissurali si estende in prossimità del tessuto aggiunto crescerà sotto l'influenza sia della lamiera del tetto endogeno e segnali del tessuto ectopico laterale. Il grado con cui sono riorientato assoni commissurali in queste circostanze può essere quantificato. Da questo test, è possibile sia per esaminare la sufficienza di un segnale particolare di riorientare gli assoni commissurali 3,4 come pure la necessità di questo segnale per dirigere la traiettoria commissurali 9.
Protocol
Discussion
I fattori critici che determinano il successo nello svolgimento di questo saggio sono prima, il tessuto non devono essere trattati con dispasi per un periodo troppo prolungato, tale trattamento sarà seguito nel tessuto diventando molto appiccicosa e con ridotta capacità di sopravvivenza. Due, il collagene deve essere perfettamente innescato e tenuta in ghiaccio il più possibile. Diventerà sempre più difficile da gestire se inizia a impostare, ad esempio si tingono di rosa. Tre, l'ago di tungsteno deve essere se…
Acknowledgements
Questo protocollo è stato sviluppato nei laboratori di Jane Dodd, Thomas Jessell e Andrew Lumsden. Molte persone, tra cui Konrad Basler, Ann Calof, Thomas Edlund, Phil Hamilton, Domna Karagogeos, Ariel Ruiz i Altaba e Toshiya Yamada determinato come espianti cultura del midollo spinale nel collagene. Marysia Placzek e Marc Tessier-Lavigne sperimentato la tecnica di usare la crescita degli assoni da espianti in vitro come mezzo per identificare molecole di guida degli assoni. Lavoro in laboratorio Butler è sostenuto da finanziamenti della March of Dimes e R01 NS063999 dal NIH / NINDS.
References
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