Этот тест оценивает способность сигнальной молекулы, здесь костные морфогенетические белки 7 (BMP7), переориентировать спаечный аксонов. Эксплантов эмбриональной спинной спинного мозга выращиваются прилегающих к совокупности COS клетки, секретирующие факторы роста кандидата. Переориентация спаечный аксонов, растущее внутри эксплантатов визуализируются по иммуногистохимии.
Abstract
Спинной спаечный аксонов в спинном мозге позвоночных 1 были неоценимую системы модель, в которой для выявления сигналов аксонов руководства. Здесь мы описываем в пробирке анализ ", переориентация анализа", который широко используется для изучения влияния внешних и внутренних сигналов от ориентации спаечный аксонов 2. Этот анализ был разработан многочисленный народ в лабораториях Джейн Додд, Томас Jessell и Эндрю Ламсден (см. благодарность за более подробной информацией) и версии данного анализа были использованы для демонстрации переориентации деятельности ключевых молекул, руководство аксонов, в том числе БМП chemorepellent в потолочной панелью 3,4 и chemoattractive деятельности Netrin1 5 и Еж Соник (SHH) 6 в пол пластины в спинном мозге.
Эксплантов включающий 2-3 сегментов спинного две трети спинного мозга расчлененное из эмбриональных день (E) 11 крыс и культивировали в трехмерном гели коллагена 7. E11 спинной спинного эксплантов содержать новорожденного спаечный нейронов, которые могут быть идентифицированы по их аксонального выражение гликопротеин, Tag1 8. В течение 30-40 часов в культуре, спаечный траектории аксона воспроизводятся в этих спинной эксплантов со временем конечно же, увидеть в естественных условиях. Это аксонального траектория может быть обжаловано путем размещения либо тест ткани или совокупности COS ячейки выражения кандидата сигнальной молекулы в контакте с одной из боковых краев спинной эксплантов. Спаечный аксонов расширения в непосредственной близости от добавляется ткань будет расти под влиянием как эндогенных пластины крыши и сигналы от внематочной боковой ткани. Степень, в которой спаечный аксоны переориентированы в этих условиях могут быть определены количественно. С помощью этого теста, можно и рассмотреть достаточность определенный сигнал для переориентации спаечный аксонов 3,4, а также необходимость для этого сигнала, чтобы направить спаечный траектории 9.
Protocol
Часть 1: Подготовка агрегатов трансфицированных клеток COS использованием висячие капли Семенной COS-7 (COS) клеток в 35 блюдах культуры. Когда они достигают 80% слияния, трансфекции 1 мкг выражения плазмиды в клетки с помощью Lipofectamine2000 в соответствии с протоколом производителя с. Дл…
Discussion
Критические факторы, которые определяют успех в выполнении этого теста во-первых, ткань не следует относиться с dispase слишком длительного периода, такое лечение может привести к ткань становится очень липким и снизившись жизнеспособность. Два, коллагена должны быть идеально загрунтова…
Acknowledgements
Этот протокол был разработан в лабораториях Джейн Додд, Томас Jessell и Эндрю Ламсден. Многие люди, в том числе Конрад Basler, Энн Calof, Томас Эдлунд, Фил Гамильтон, Домна Karagogeos, Ариэль Руис я Altaba и Toshiya Ямада определяется как культура эксплантов спинного мозга в коллагене. Марыся Плачека и Марк Тессье-Лавинь впервые методика использования аксон рост в пробирке из эксплантов в качестве средства идентификации молекул аксон руководства. Работа в Батлер лаборатории поддержана грантами марте Dimes и R01 NS063999 из NIH / NINDS.
Hazen, V. M., Phan, K., Yamauchi, K., Butler, S. J. Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons. J. Vis. Exp. (37), e1853, doi:10.3791/1853 (2010).