כאן אנו מציגים שיטה לבודד cerebellar תרבות גרגר עצב ובתאים ונוירונים גרגיר cerebellar מהעכבר לאחר הלידה.
Abstract
קליפת המוח הקטן הוא מבנה תיאר היטב המספק הזדמנויות ייחודיות ללימוד המאפיינים עצב 1,2 פיתוח. סוגי נוירונים המוח הקטן (תאים גרגיר, תאים פורקינג' ו interneurons מעכבות), גרגיר נוירונים הם ללא ספק רבים ביותר הן הסוג הנפוץ ביותר של הנוירונים במוח היונקים. במכרסמים, הנוירונים גרגיר cerebellar נוצרות במהלך שני הראשונים שלאחר הלידה שבועות ובתאים בשכבה החיצונית של קליפת המוח הקטן, את השכבה החיצונית גרגיר (EGL). הפרוטוקול המובא כאן מתאר טכניקות להעשיר גרגיר נוירונים תרבות ובתאים שלהם המוח הקטן שלאחר הלידה העכבר. נתאר הליכים כדי להשיג תרבויות של טוהר הגדלת 3,4, אשר ניתן להשתמש בהם כדי ללמוד את הבידול של מתרבים ובתאים לתוך הנוירונים גרגיר 5,6. לאחר ובתאים להבדיל, התרבויות גם לספק אוכלוסייה הומוגנית של נוירונים גרגיר מניפולציה אפיון ניסיוני של תופעות כגון synaptogenesis, פונקציה קולטן הגלוטמט 7, אינטראקציה עם תאים אחרים cerebellar מטוהרים 8,9 או מוות של תאים 7.
Protocol
חלק 1: הגדרת (1-2 ימים לפני הניתוח) (לא מוצג וידאו) הכנת פתרונות תרבות MEDIA: 4X-CMF PBS-EDTA (סידן ומגנזיום חופשי פוספט שנאגרו מלוחים EDTA עבור דילולים Percoll): ליטר, להוסיף 32 גרם NaCl, 1.2 גרם…
Discussion
פרוטוקול זה מבוסס על שינויים של נהלים אשר תוארו 3,7,11 האחרונות. ישנן מספר נקודות חשובות לציין כמפורט להלן.
הנוירונים גרגיר ו ובתאים לדבוק בתוך 2 שעות של ציפוי. בתאים בריאים יש מורפולוגיה עגול תחת 4 שלב הניגוד מיקרוסקופ. תוך 24 שעות לאחר ציפוי, תא…
Acknowledgements
אנו מודים ברברה קארלטי אנה מארי קני הצעות שלא יסולא בפז. HYL נתמך על ידי מענק הכשרה "הורמונים: לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית", DK07328. נתמך בחלקו על ידי מענק 5R01-NIH NS16951 (רמ"א).
Ruiz I Altaba, A. .Development. 126, 3205-3205 (1999).
Wallace, V. A. .Current Biology. 9 (8), 445-445 (1999).
Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. .Neuron. 22 (1), 103-103 (1999).
Solecki, D. J., Liu, X. L., Tomoda, T. .Neuron. 31 (4), 557-557 (2001).
Powell, S. K., Williams, C. C., Nomizu, M. .Journal of Neuroscience Research. 54 (2), 233-233 (1998).
Lander, A. D., Fujii, D. K., Reichardt, L. F. .Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (7), 2183-2183 (1985).
Kenney, A. M., Rowitch, D. H. .Molecular and Cellular Biology. 20 (23), 9055-9055 (2000).
Kenney, A. M., Cole, M. D., Rowitch, D. H. .Development. 130 (1), 15-15 (2003).
Pons, S., Trejo, J. L., Martinez-Morales, J. R. .Development. 128, 1481-1481 (2001).
Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons . J. Vis. Exp. (23), e990, doi:10.3791/990 (2009).