产后小鼠小脑颗粒神经元祖细胞和神经元的分离和培养
Summary
在这里，我们提出了一个方法来隔离和文化的小脑颗粒神经元祖细胞和产后小鼠小脑颗粒神经元。
Abstract
小脑皮层是一个很好的描述的结构，为研究神经元的性质和发展1,2提供了独特的机会。小脑的神经元类型（颗粒细胞，浦肯野细胞和抑制interneurons），颗粒神经元是目前最众多的和最丰富的哺乳动物的大脑中的神经元类型。在啮齿类动物中，小脑颗粒神经元在小脑皮质，外部颗粒层（EGL）的最外层产后的前两个星期祖细胞生成的。这里介绍的协议描述的技术来丰富和文化产后小鼠小脑颗粒神经元祖细胞。我们将描述的程序，以获取增加纯度 3,4 文化，它可以被用来研究颗粒神经元的增殖到5,6祖细胞的分化。一旦祖细胞分化，文化也提供实验操作和现象，如突触谷氨酸受体功能 7，与其他纯化的小脑细胞8,9或细胞死亡7的互动特征的颗粒神经元的同质人口。
Protocol
第1部分：设置（清扫术前1-2天）（不显示视频） 编制文化的解决方案和介质： 4X CMF – PBS – EDTA（钙和镁的磷酸盐缓冲液EDTA Percoll稀释）：每公升，加入32 g氯化钠，氯化钾1.2克，8克葡萄糖，2克的NaH 2 PO 4，1克KH 2 PO 4，8毫升2％碳酸氢钠3股票，10毫升1M EDTA（pH 8.0）的蒸馏水/去离子水。调节音量到1升，pH值至7.4。过滤消毒。 HBSS中葡萄糖?…
Discussion
这个协议是基于已在过去的3,7,11描述程序的修改。有几个重要的点要注意下面讨论。
坚持在2小时电镀内的颗粒神经元细胞和祖细胞。健康的细胞有在相衬显微镜 4下一轮形态。电镀后的24小时之内，健康的细胞将盖玻片或塑料以及周围均匀分布，并会形成过程。第一介质的变化时，24小时后，将有几个死浮动细胞。这是正常的，少数细胞会死亡或解离过程中变得不健康。然而，如果48小时后?…
Acknowledgements
我们感谢芭芭拉Carletti和安娜玛丽肯尼宝贵的意见。 HYL是支持的培训津贴“荷尔蒙：生物化学与分子生物学”，DK07328。支持由美国国立卫生研究院授予5R01 NS16951（CAM）的一部分。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cell strainer with 70μm mesh pore | BD Biosciences | 352350 | ||
| Spinal Needle | BD | 405182 | 20G x 3-1/2 inches | |
| Poly-D-Lysine mol wt>300,000 | Sigma | P1024 | Each new batch of Poly-D-Lysine must be tested. | |
| Percoll | Sigma | P-1644 | ||
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Sigma | P4333 | ||
| HBSS | Invitrogen | 14175-103 | Must be calcium and magnesium free. | |
| Neurobasal A-Medium | Invitrogen | 10888-022 | ||
| Glutamax I supplement | Invitrogen | 35050-061 | ||
| B-27 Serum Free Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | ||
| 12-mm circle coverslips | Carolina Biological Supply | 63-3029 | These are made in Germany by Deckgluder. | |
| 25-mm circle coverslips | Carolina Biological Supply | 63-3037 | These are made in Germany by Deckgluder. | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK 003150 | Kit is good for five isolations. | |
| Permaset scissors | Roboz | RS6782 | ||
| Dumont #5 (Dumostar) | Roboz | RS4978 | ||
| 4-well culture dish | Nunc | 176740 | ||
| 6-well culture dish | Nunc | 140685 |
References
- Altman, J., Bayer, S. A. . Development of the cerebellar system: in relation to its evolution, structure, and functions. , (1997).
- Hatten, M. E., Heintz, N. . Annual Review of Neuroscience. 18, 385-285 (1995).
- Hatten, M. E., Gao, W. -. Q., Morrison, M. E., Banker, G., Goslin, K. . in Culturing Nerve Cells. , 419-419 (1998).
- Hatten, M. E. . The Journal of Cell Biology. 100 (2), 384-384 (1985).
- Carletti, B., Rossi, F. . Neuroscientist. 14 (1), 91-91 (2008).
- Knoepfler, P. S., Kenney, A. M. . Cell Cycle. 5 (1), 47-47 (2006).
- Manzini, M. C., Joseph, D. J., MacDermott, A. B. . Molecular and Cellular Neuroscience. 35 (2), 328-328 (2007).
- Manzini, M. C., Ward, M. S., Zhang, Q. . Journal of Neuroscience. 26 (22), 6040-6040 (2006).
- Baptista, C. A., Hatten, M. E., Blazeski, R. . Neuron. 12 (2), 243-243 (1994).
- Palay, S. L., Chan-Palay, V. . Cerebellar Cortex: Cytology and Organization. , (1974).
- Messer, A. . Brain Research. 130 (1), 1-1 (1977).
- Ruiz I Altaba, A. . Development. 126, 3205-3205 (1999).
- Wallace, V. A. . Current Biology. 9 (8), 445-445 (1999).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. . Neuron. 22 (1), 103-103 (1999).
- Solecki, D. J., Liu, X. L., Tomoda, T. . Neuron. 31 (4), 557-557 (2001).
- Powell, S. K., Williams, C. C., Nomizu, M. . Journal of Neuroscience Research. 54 (2), 233-233 (1998).
- Lander, A. D., Fujii, D. K., Reichardt, L. F. . Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (7), 2183-2183 (1985).
- Kenney, A. M., Rowitch, D. H. . Molecular and Cellular Biology. 20 (23), 9055-9055 (2000).
- Kenney, A. M., Cole, M. D., Rowitch, D. H. . Development. 130 (1), 15-15 (2003).
- Pons, S., Trejo, J. L., Martinez-Morales, J. R. . Development. 128, 1481-1481 (2001).
Tags
IsolationCulturePost-natalMouse CerebellarGranule Neuron Progenitor CellsNeuronsCerebellar CortexNeuronal PropertiesDevelopmentGranule NeuronsPurkinje CellsInhibitory InterneuronsMammalian BrainRodentsExternal Granule Layer (EGL)EnrichmentPurityDifferentiationProliferating Progenitor CellsSynaptogenesisGlutamate Receptor FunctionInteraction With Other Purified Cerebellar CellsCell Death
Cite This Article
Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons . J. Vis. Exp. (23), e990, doi:10.3791/990 (2009).