Coleta de sangue do caranguejo em ferradura americano, Limulus Polyphemus

Summary

O caranguejo-ferradura americano, Limulus polyphemus, é sem dúvida a fonte mais conveniente para grandes quantidades de sangue de invertebrados. O sangue é simples na composição, com apenas um tipo celular na circulação geral, o Amebocyte granular, e apenas três proteínas abundante no plasma, hemocianina, as proteínas C-reativa e α2-macroglobulina. O sangue é coletado a partir do coração e as células de sangue e plasma são separados por centrifugação.

Abstract

O caranguejo-ferradura tem o melhor sistema imunológico caracterizada de qualquer invertebrados de vida longa. O estudo da imunidade em caranguejos-ferradura tem sido facilitada pela facilidade na coleta de grandes volumes de sangue e da simplicidade do sangue. Caranguejos-ferradura mostrar apenas um único tipo de células na circulação geral, o Amebocyte granular. O plasma tem o teor de sal da água do mar e apenas três proteínas abundantes, hemocianina, a proteína respiratória, as proteínas C-reativa, que funcionam na destruição citolítica de células estrangeiras, incluindo as células bacterianas, e α2-macroglobulina, que inibe as proteases de patógenos invasores. O sangue é coletado por punção cardíaca direta sob condições que minimizem a contaminação por lipopolissacarídeo (endotoxina, aka, LPS), um produto das bactérias Gram-negativas. Um animal de grande porte pode gerar 200-400 mL de sangue. Para o estudo do plasma, glóbulos são imediatamente removidos do plasma por centrifugação e do plasma pode ser fracionado em suas proteínas constituintes. As células do sangue são convenientemente estudado microscopicamente através da recolha de pequenos volumes de sangue em LPS-livre salina isotônica (0,5 M NaCl) em condições que permitam o exame microscópico direto, colocando uma das mais LPS-livre esfregaços na superfície placa de cultura, então a montagem dos esfregaços em câmaras de observação simples, após fixação das células. A preparação para a segunda observação direta é coletar 3-5 mL de sangue em um prato embrião LPS-livre e então explanting fragmentos de amebocytes agregados a uma câmara que sanduíches de tecido entre um slide e uma lamela. Nessa preparação, a amebocytes móveis migram para a superfície lamela, onde podem ser facilmente observadas. O sistema de coagulação do sangue envolve agregação de amebocytes ea formação de um coágulo extracelular de uma proteína, coagulin, que é liberado dos grânulos de secreção das células do sangue. Análise bioquímica de células do sangue lavado exige que a agregação e degranulação não ocorrer, o que pode ser realizado através da recolha de sangue para 0,1 volumes de 2% Tween-20, 0,5 M NaCl LPS-free, M seguida de centrifugação das células e lavagem com 0,5 NaCl.

Protocol

Características anatômicas do caranguejo-ferradura relevantes para sangramento (Fig. 1) Figura 1 Os três principais divisões do corpo, no sentido antero-posterior, são as prosoma (P), o opisthosoma (O), eo telson (T) 1. As margens anterior e lateral livre do prosoma é a flange. O recuo posterio…

Discussion

Existem quatro espécies de caranguejo-ferradura, polyphemus Limulus da costa leste da América do Norte e três espécies que vão do Japão para a Baía de Bengala. O animal é identificado como um "fóssil vivo" por formas anatomicamente semelhantes foram encontrados como fósseis de 445 milhões de anos atrás ^27. O caranguejo-ferradura representa um animal de vida longa, exigindo 10-13 anos para atingir a maturidade e viver pelo menos 20 anos ^28. Embora tenha sido submetido a colheita extensa co…