Summary

Estrategia para el biobanco de organoides de cáncer de ovario: abordaje de la heterogeneidad entre pacientes en los subtipos histológicos y los estadios de la enfermedad

Published: February 23, 2024
doi:

Summary

Este protocolo ofrece un marco sistemático para el establecimiento de organoides de cáncer de ovario de diferentes estadios de la enfermedad y aborda los desafíos de la variabilidad específica del paciente para aumentar el rendimiento y permitir una expansión robusta a largo plazo para aplicaciones posteriores. Incluye pasos detallados para el procesamiento de tejidos, la siembra, el ajuste de los requisitos de medios y la tinción de inmunofluorescencia.

Abstract

Si bien el establecimiento de un biobanco de cáncer de ovario a partir de organoides derivados de pacientes junto con su información de antecedentes clínicos promete avances en la investigación y la atención al paciente, la estandarización sigue siendo un desafío debido a la heterogeneidad de esta neoplasia maligna letal, combinada con la complejidad inherente de la tecnología de organoides. Este protocolo adaptable proporciona un marco sistemático para aprovechar todo el potencial de los organoides del cáncer de ovario teniendo en cuenta la variabilidad de los progenitores específica de cada paciente. Mediante la implementación de un flujo de trabajo experimental estructurado para seleccionar las condiciones óptimas de cultivo y los métodos de siembra, con pruebas paralelas de siembra directa en 3D frente a una ruta 2D/3D, obtenemos, en la mayoría de los casos, líneas de expansión robustas a largo plazo adecuadas para una amplia gama de aplicaciones posteriores.

En particular, el protocolo ha sido probado y ha demostrado su eficacia en un gran número de casos (N = 120) de material de partida muy heterogéneo, incluido el cáncer de ovario de alto y bajo grado y los estadios de la enfermedad con citorreducción primaria, enfermedad recurrente y muestras quirúrgicas posneoadyuvantes. Dentro de un entorno de señalización exógena de bajo Wnt y alto BMP, observamos que los progenitores son susceptibles de manera diferente a la activación de la vía de la heregulina 1 ß (HERß-1), con HERß-1 promoviendo la formación de organoides en algunos mientras que la inhibe en otros. Para un subconjunto de las muestras del paciente, la formación óptima de organoides y el crecimiento a largo plazo requieren la adición del factor de crecimiento de fibroblastos 10 y R-Espondina 1 al medio.

Además, destacamos los pasos críticos de la digestión de los tejidos y el aislamiento de los progenitores y señalamos ejemplos en los que el cultivo breve en 2D sobre plástico es beneficioso para la posterior formación de organoides en la matriz del extracto de membrana basal tipo 2. En general, un biobanco óptimo requiere pruebas sistemáticas de todas las condiciones principales en paralelo para identificar un entorno de crecimiento adecuado para las líneas individuales. El protocolo también describe el procedimiento de manipulación para la inclusión, el corte y la tinción eficientes para obtener imágenes de alta resolución de los organoides, que se requiere para un fenotipado completo.

Introduction

El manejo clínico de las pacientes con cáncer epitelial de ovario sigue siendo un reto debido a su presentación clínica heterogénea en estadios avanzados y a las altas tasas de recurrencia1. Mejorar nuestra comprensión del desarrollo del cáncer de ovario y el comportamiento biológico requiere enfoques de investigación que aborden la variabilidad específica de la paciente durante el curso de la enfermedad, la respuesta al tratamientoy las características histopatológicas y moleculares.

El biobanco, caracterizado por la recolección sistemática y la preservación a largo plazo de muestras tumorales derivadas de pacientes con cáncer de ovario junto con su información clínica, ofrece la preservación de una gran cohorte de pacientes en diferentes etapas de la enfermedad, incluidas muestras tumorales de cirugías citorreductoras primarias, después de quimioterapia neoadyuvante y de enfermedad recurrente. Tiene un valioso potencial para avanzar en la investigación del cáncer, sirviendo como un recurso de biomarcadores pronósticos prometedores y dianas terapéuticas3. Sin embargo, los métodos convencionales de biobancos, como la fijación y congelación de formol, no son susceptibles de realizar estudios funcionales en las muestras tumorales originales debido a la pérdida de viabilidad y a la alteración de la arquitectura tridimensional del tejido nativo 4,5.

Los estudios de los mecanismos moleculares, en oncología y fuera de ella, dependen fundamentalmente del uso de modelos experimentales apropiados que reflejen fielmente la biología de la enfermedad y mantengan las propiedades in vitro del tejido observado in vivo. Los organoides derivados del paciente, basados en la preservación del potencial de renovación, reproducen en el laboratorio la estructura y función originales del epitelio y permiten realizar pruebas en un contexto específico del paciente. Por lo tanto, se han convertido en herramientas muy prometedoras para la investigación del cáncer y la medicina personalizada, cerrando la brecha entre la diversidad clínica y la investigación de laboratorio 6,7,8,9. Las estrategias terapéuticas personalizadas, basadas en las respuestas farmacológicas individuales de las líneas de organoides y en las pruebas de la relevancia funcional de los perfiles moleculares, pueden aplicarse directamente a la atención del paciente10,11. La posibilidad de cultivo a largo plazo, incluyendo las características específicas del paciente y la recopilación de datos clínicos prospectivos relevantes a lo largo del tiempo, es muy prometedora para identificar nuevos factores pronósticos y predictivos implicados en la progresión de la enfermedad y los mecanismos de resistencia 3,9.

Sin embargo, la construcción de un biobanco que incluya organoides de diferentes muestras tumorales requiere una combinación de cumplimiento estricto de una metodología compleja y el establecimiento de protocolos para facilitar su mantenimiento12. La estandarización de los procesos garantiza que el biobanco pueda ser establecido y mantenido de manera eficiente por personal capacitado, incluso con una alta rotación, al mismo tiempo que se adhiere a los más altos estándares de calidad13. Varios estudios informaron la generación exitosa de líneas organoides estables de cáncer de ovario correspondientes al perfil mutacional y fenotípico del tumor original con tasas de eficiencia variables. Aun así, los biobancos rutinarios siguen siendo un reto en la práctica, especialmente para el crecimiento estable a largo plazo de las líneas, que es un requisito previo para la expansión a gran escala o el éxito de la edición genómica.

En particular, la cuestión de la capacidad de expansión sigue estando vagamente definida en el campo, ya que los organoides que muestran un potencial de crecimiento lento y limitado se cuentan ocasionalmente como líneas establecidas. Como demostraron inicialmente Hoffmann et al., un estudio cuyos principales hallazgos proporcionaron la base para este protocolo más desarrollado, el manejo óptimo del tejido de cáncer de ovario requiere una estrategia única para acomodar la heterogeneidad14. La caracterización fenotípica de los organoides obtenidos por este método y la estrecha similitud con el tejido tumoral parental se confirmaron mediante secuenciación de ADN de panel y análisis transcriptómico de cultivos maduros (4-10 meses de cultivo), demostrando la estabilidad del modelo 8,9,12,14.

En contraste con el ambiente paracrino que regula la homeostasis en las trompas de Falopio sanas, la capa epitelial, que probablemente produce cáncer de ovario seroso de alto grado (HGSOC), el potencial de regeneración del cáncer y la capacidad de formación de organoides, depende menos de la suplementación exógena con Wnt. Además, la señalización activa de la Proteína Morfogenética Ósea (BMP), caracterizada por la ausencia de Noggin en medio organoide, demostró ser beneficiosa para el establecimiento de cultivos a largo plazo a partir de depósitos de tejido sólido de cáncer de ovario14,15. Durante el biobanco sistemático de depósitos sólidos de cáncer de ovario, hemos confirmado estos hallazgos y hemos establecido la canalización, con detalles descritos en este protocolo que garantiza una expansión sostenida a largo plazo en la mayoría de los casos. Encontramos que las pruebas paralelas de diferentes composiciones de medios y modalidades de siembra cuando se trabaja con aislados primarios son esenciales para mejorar el establecimiento de líneas de organoides estables a largo plazo y para aumentar los rendimientos, lo que permite una propagación robusta y la expansión a formatos de pocillos múltiples requeridos para experimentos posteriores16.

Además, la pureza y la calidad de las muestras recogidas durante la cirugía son de crucial importancia para el potencial traslacional de los organoides del cáncer de ovario en la investigación básica y el diagnóstico molecular. La complejidad de la presentación clínica del HGSOC requiere una estrecha cooperación entre los cirujanos, oncólogos y los científicos del laboratorio para garantizar que el material relevante se identifique correctamente, que las condiciones de transporte se mantengan constantes y que se generen líneas de organoides con alta eficiencia que representen las características más importantes de la enfermedad de cada paciente. Este protocolo proporciona un marco estandarizado pero adaptable para capturar todo el potencial de los organoides del cáncer de ovario, considerando la heterogeneidad que caracteriza al cáncer de ovario16,17. En particular, este protocolo permite un biobanco confiable del amplio espectro de presentación clínica del cáncer de ovario, incluidos diferentes tipos histológicos (cáncer de ovario de alto y bajo grado, LGSOC), diferentes depósitos de las mismas pacientes que presentan diferencias en la regulación de la madre, tejidos de cirugías en un entorno posneoadyuvante, material de biopsia y muestras de cirugías en la fase recurrente de la progresión de la enfermedad.

Protocol

Se recolectaron muestras de tejido tumoral de cirugías de cáncer de ovario y se generaron organoides derivados de pacientes de acuerdo con el Comité de Ética de la Universidad LMU (17-471), adhiriéndose a las regulaciones vigentes aplicables de la UE, nacionales y locales. Cada paciente que participa en el estudio ha dado su consentimiento por escrito. Cuando se trabaja con muestras de tejido fresco, se requiere un permiso de seguridad de nivel 2 de bioseguridad y cabinas de flujo laminar. Dada la naturaleza potenci…

Representative Results

Después de la disociación, filtración y recuento inicial de tejidos, las células se siembran en paralelo directamente en formato 3D, como se explicó anteriormente, así como la suspensión en el matraz para una breve expansión 2D. En algunos casos, la expansión transitoria 2D influye positivamente en la formación de organoides, y la línea a largo plazo se establece con éxito a través de esta ruta, mientras que la siembra 3D paralela comparativa puede resultar en la detención del crecimiento (<strong class="xf…

Discussion

El protocolo diseñado aborda los desafíos previos del biobanco de organoides de cáncer de ovario con respecto a la formación de organoides y el potencial de paso a largo plazo y garantiza la generación de líneas completamente expandibles a partir de la mayoría de los depósitos de tumores sólidos. El proceso de recolección quirúrgica de muestras tumorales que se utilizarán para la generación de organoides tiene un impacto significativo en el rendimiento y el potencial de expansión. Las muestras de tejido tum…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

El estudio está financiado por el Centro Alemán de Investigación del Cáncer DKTK, sede asociada de Múnich, una asociación entre DKFZ y el Hospital Universitario LMU de Múnich. El estudio también cuenta con el apoyo de la beca German Cancer Aid (#70113426 y #70113433). La inclusión en parafina de tejidos y organoides se ha realizado en las instalaciones centrales del Instituto de Anatomía de la Facultad de Medicina de la LMU de Múnich. La obtención de imágenes confocales se ha realizado en la instalación principal de bioimagen en el Centro Biomédico (BMC). Los autores quieren agradecer a Simone Hofmann, Maria Fischer, Cornelia Herbst, Sabine Fink y Martina Rahmeh por su ayuda técnica.

Materials

100 Sterican 26 G Braun, Melsungen, Germany 4657683
100 Sterican 27 G Braun, Melsungen, Germany 4657705
293T HA Rspo1-Fc R&D systems, Minneapolis, USA 3710-001-01 Alternative: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111
A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV) Merck, Darmstadt, Germany 616454
Advanced DMEM/F-12 Medium  Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA 12634028
Anti-p53 antibody (DO1) Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA sc-126
Anti-PAX8 antibody Proteintech, Manchester, UK  10336-1-AP
B-27 Supplement (50x) Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA 17504-044
Bottle-top vacuum filter 0.2 µm Corning, Berlin, Germany  430049
CELLSTAR cell culture flask, 175 cm2 Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria 661175
CELLSTAR cell culture flask, 25 cm2 Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria 690160
CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2 Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria 658175
Collagenase I Thermo Scientific, Waltham, USA 17018029
Costar 48-well Clear TC-treated  Corning, Berlin, Germany  3548
Cryo SFM PromoCell – Human Centered Science, Heidelberg, Germany C-29912
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, Pathclear R&D systems, Minneapolis, USA 3533-005-02 Alternative: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix  Corning, 356231 
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG Jackson Immuno 715-175-151
DAKO  Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen Retriever Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany C9999-1000ML
DAPI Thermo Scientific, Waltham, USA 62248
Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555 Thermo Scientific, Waltham, USA A32794
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488 Thermo Scientific, Waltham, USA A32814
Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline  Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA 14190-094
Epredia Richard-Allan Scientific HistoGel Thermo Scientific, Waltham, USA Epredia HG-4000-012
Falcon 24-well Polystyrene  Corning, Berlin, Germany  351447
Feather scalpel  Pfm medical, Cologne, Germany 200130010
Fetal Bovine Serum Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA 10270106
Formalin 37% acid free, stabilized Morphisto, Offenbach am Main, Germany 1019205000
GlutaMAX Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA 35050038
HEPES (1 M) Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA 156630080
Human EpCAM/TROP-1 Antibody R&D systems, Minneapolis, USA AF960
Human FGF10 Peprotech, NJ, USA 100-26
Human recombinant BMP2 Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA PHC7146
Human recombinant EGF Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA PHG0311L
Human recombinant Heregulin beta-1 Peprotech, NJ, USA 100-03
LAS X core Software Leica Microsystems https://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/
Leica TCS SP8 X White Light Laser Confocal Microscope Leica Microsystems
N-2 Supplement (100x) Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA 17502-048
Nicotinamide Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany N0636
Omnifix 1 mL Braun, Melsungen, Germany 3570519
Paraffin
Parafilm Omnilab, Munich, Germany 5170002
Paraformaldehyd  Morphisto, Offenbach am Main, Germany 1176201000
Pen Strep Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA 15140-122
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany P4333-100
PluriStrainer 400 µm PluriSelect, Leipzig, Germany 43-50400-01
Primocin InvivoGen, Toulouse, France ant-pm-05
Red Blood Cell Lysing Buffer Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany 11814389001
Roticlear Carl Roth, Karlsruhe, Germany A538.5
Surgipath Paraplast Leica, Wetzlar, Germany 39602012
Thermo Scientific Nunc Cryovials Thermo Scientific, Waltham, USA 375418PK
Triton X-100 Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany T8787
Trypan Blue Stain Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany T8154
TrypLE Express Enzyme  Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA 12604-013
Tween-20 PanReac AppliChem, Darmstadt, Germany A4974-0100
Y-27632 TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany 1254
Zeocin Invitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USA R25001

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Trillsch, F., Reichenbach, J., Czogalla, B., Kraus, F., Burges, A., Mahner, S., Kessler, M. Strategy for Biobanking of Ovarian Cancer Organoids: Addressing the Interpatient Heterogeneity across Histological Subtypes and Disease Stages. J. Vis. Exp. (204), e66467, doi:10.3791/66467 (2024).

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