Dit protocol biedt een systematisch kader voor de oprichting van organoïden van eierstokkanker uit verschillende ziektestadia en pakt de uitdagingen van patiëntspecifieke variabiliteit aan om de opbrengst te verhogen en robuuste uitbreiding op lange termijn mogelijk te maken voor volgende toepassingen. Het bevat gedetailleerde stappen voor weefselverwerking, zaaien, het aanpassen van mediavereisten en immunofluorescentiekleuring.
Hoewel de oprichting van een biobank voor eierstokkanker op basis van van patiënten afgeleide organoïden samen met hun klinische achtergrondinformatie vooruitgang in onderzoek en patiëntenzorg belooft, blijft standaardisatie een uitdaging vanwege de heterogeniteit van deze dodelijke maligniteit, gecombineerd met de inherente complexiteit van organoïdetechnologie. Dit aanpasbare protocol biedt een systematisch kader om het volledige potentieel van organoïden voor eierstokkanker te realiseren, rekening houdend met een patiëntspecifieke variabiliteit van voorlopercellen. Door een gestructureerde experimentele workflow te implementeren om optimale kweekomstandigheden en zaaimethoden te selecteren, met parallelle tests van direct 3D-zaaien versus een 2D/3D-route, verkrijgen we in de meeste gevallen robuuste uitbreidingslijnen voor de lange termijn die geschikt zijn voor een breed scala aan stroomafwaartse toepassingen.
Het protocol is met name getest en efficiënt gebleken in een groot aantal gevallen (N = 120) van zeer heterogeen uitgangsmateriaal, waaronder hooggradige en laaggradige eierstokkanker en stadia van de ziekte met primaire debulking, recidiverende ziekte en post-neoadjuvante chirurgische monsters. Binnen een exogene signaalomgeving met een laag Wnt en een hoge BMP zagen we dat voorlopercellen verschillend gevoelig waren voor de activering van de Heregulin 1 ß (HERß-1)-route, waarbij HERß-1 bij sommigen de vorming van organoïden bevorderde en bij anderen remde. Voor een subset van de monsters van de patiënt vereisen optimale organoïdevorming en groei op lange termijn de toevoeging van fibroblastgroeifactor 10 en R-Spondin 1 aan het medium.
Verder belichten we de cruciale stappen van weefselvertering en isolatie van voorlopercellen en wijzen we op voorbeelden waarbij korte kweek in 2D op plastic gunstig is voor de daaropvolgende vorming van organoïden in de Basement Membrane Extract type 2-matrix. Over het algemeen vereist een optimale biobanking het systematisch testen van alle belangrijke voorwaarden parallel om een geschikte groeiomgeving voor individuele lijnen te identificeren. Het protocol beschrijft ook de hanteringsprocedure voor efficiënte inbedding, doorsnede en kleuring om afbeeldingen met hoge resolutie van organoïden te verkrijgen, wat nodig is voor uitgebreide fenotypering.
De klinische behandeling van patiënten met epitheliale eierstokkanker blijft een uitdaging vanwege de heterogene klinische presentatie in een vergevorderd stadium en de hoge recidiefpercentages1. Om ons begrip van de ontwikkeling en het biologische gedrag van eierstokkanker te verbeteren, zijn onderzoeksbenaderingen nodig die zich richten op de patiëntspecifieke variabiliteit in de loop van de ziekte, de respons op de behandeling en histopathologische en moleculaire kenmerken.
Biobanking, gekenmerkt door het systematisch verzamelen en langdurig bewaren van tumormonsters afkomstig van patiënten met eierstokkanker, samen met hun klinische informatie, biedt het behoud van een groot patiëntencohort in verschillende ziektestadia, inclusief tumormonsters van primaire debulking-operaties, na neoadjuvante chemotherapie en van terugkerende ziekte. Het heeft een waardevol potentieel voor het bevorderen van kankeronderzoek en dient als een bron van veelbelovende prognostische biomarkers en therapeutische doelen3. Conventionele biobankmethoden, zoals formalinefixatie en bevriezing, zijn echter niet geschikt voor het uitvoeren van functionele studies op de oorspronkelijke tumormonsters vanwege het verlies van levensvatbaarheid en de verstoring van de oorspronkelijke driedimensionale weefselarchitectuur 4,5.
Studies van moleculaire mechanismen, in de oncologie en daarbuiten, zijn in belangrijke mate afhankelijk van het gebruik van geschikte experimentele modellen die de biologie van de ziekte getrouw weergeven en de in vitro waargenomen eigenschappen van het in vivo waargenomen weefsel behouden. Patiënt-afgeleide organoïden, gebaseerd op het behoud van het vernieuwingspotentieel, reproduceren in het laboratorium de oorspronkelijke structuur en functie van het epitheel en maken testen in een patiëntspecifieke context mogelijk. Daarom zijn ze naar voren gekomen als veelbelovende hulpmiddelen voor kankeronderzoek en gepersonaliseerde geneeskunde, waarbij de kloof tussen klinische diversiteit en laboratoriumonderzoek wordt overbrugd 6,7,8,9. Op maat gemaakte therapeutische strategieën op basis van individuele geneesmiddelresponsen van organoïdelijnen en het testen van de functionele relevantie van moleculaire profielen, kunnen mogelijk direct worden toegepast op patiëntenzorg10,11. De mogelijkheid van langdurige teelt, met inbegrip van patiëntspecifieke kenmerken en het verzamelen van relevante prospectieve klinische gegevens in de loop van de tijd, is veelbelovend voor het identificeren van nieuwe prognostische en voorspellende factoren die betrokken zijn bij ziekteprogressie en resistentiemechanismen 3,9.
Desalniettemin vereist het bouwen van een biobank met organoïden uit verschillende tumormonsters een combinatie van strikte naleving van complexe methodologie en het opzetten van protocollen voor eenvoudig onderhoud12. Processtandaardisatie zorgt ervoor dat de biobank efficiënt kan worden opgezet en onderhouden door opgeleid personeel, zelfs bij een hoog verloop, terwijl tegelijkertijd wordt voldaan aan de hoogste kwaliteitsnormen13. Verschillende studies rapporteerden de succesvolle generatie van stabiele organoïdelijnen voor eierstokkanker die overeenkomen met het mutatie- en fenotypische profiel van de oorspronkelijke tumor met verschillende efficiëntiepercentages. Toch blijft routinematig biobankieren in de praktijk een uitdaging, met name voor een stabiele groei van lijnen op lange termijn, wat een voorwaarde is voor grootschalige uitbreiding of succesvolle genomische bewerking.
Met name de kwestie van uitbreidbaarheid blijft vaag gedefinieerd in het veld, aangezien organoïden die een langzaam en beperkt groeipotentieel vertonen, af en toe als gevestigde lijnen worden geteld. Zoals aanvankelijk aangetoond door Hoffmann et al., een studie waarvan de belangrijkste bevindingen de basis vormden voor dit verder ontwikkelde protocol, vereist een optimale behandeling van eierstokkankerweefsel een unieke strategie om tegemoet te komen aan heterogeniteit14. Fenotypische karakterisering van de organoïden verkregen met deze methode en nauwe gelijkenis met ouderlijk tumorweefsel werden bevestigd door panel DNA-sequencing en transcriptomics-analyse van rijpe culturen (4-10 maanden cultivatie) die de stabiliteit van het model aantoonden 8,9,12,14.
In tegenstelling tot de paracriene omgeving die de homeostase in de gezonde eileiders reguleert, is de epitheellaag, die waarschijnlijk hooggradige sereuze eierstokkanker (HGSOC), kankerregeneratiepotentieel en organoïdevormingscapaciteit oplevert, minder afhankelijk van exogene Wnt-suppletie. Bovendien bleek actieve botmorfogenetische proteïne (BMP)-signalering, gekenmerkt door de afwezigheid van Noggin in organoïdemedium, gunstig te zijn voor de vestiging van langetermijnculturen van vaste weefselafzettingen van eierstokkanker14,15. Tijdens het systematisch biobankieren van vaste afzettingen van eierstokkanker hebben we deze bevindingen bevestigd en de pijplijn opgezet, met details die in dit protocol worden beschreven en dat in de meeste gevallen een duurzame uitbreiding op lange termijn garandeert. We vinden dat het parallel testen van verschillende mediasamenstellingen en zaaimodaliteiten bij het werken met primaire isolaten essentieel is om de totstandbrenging van stabiele organoïdelijnen op lange termijn te verbeteren en de opbrengst te verhogen, waardoor robuuste vermeerdering en uitbreiding naar multi-well-formaten mogelijk wordt die nodig zijn voor stroomafwaartse experimenten16.
Bovendien zijn de zuiverheid en kwaliteit van de monsters die tijdens de operatie worden verzameld van cruciaal belang voor het translationele potentieel van organoïden voor eierstokkanker in fundamenteel onderzoek en moleculaire diagnostiek. De complexiteit van de klinische presentatie van HGSOC vereist nauwe samenwerking tussen de chirurgen, oncologen en de wetenschappers in het laboratorium om ervoor te zorgen dat relevant materiaal correct wordt geïdentificeerd, de transportomstandigheden constant worden gehouden en organoïdelijnen worden gegenereerd met een hoge efficiëntie die de belangrijkste kenmerken van de ziekte van elke patiënt vertegenwoordigen. Dit protocol biedt een gestandaardiseerd maar aanpasbaar raamwerk om het volledige potentieel van eierstokkankerorganoïden vast te leggen, rekening houdend met de heterogeniteit die eierstokkanker kenmerkt16,17. Dit protocol maakt met name een betrouwbare biobank mogelijk van het brede spectrum van de klinische presentatie van eierstokkanker, inclusief verschillende histologische typen (hooggradige en laaggradige eierstokkanker, LGSOC), verschillende afzettingen van dezelfde patiënten die verschillen vertonen in stamregulatie, weefsels van operaties in post-neoadjuvante setting, biopsiemateriaal en monsters van operaties in de terugkerende fase van ziekteprogressie.
Het ontworpen protocol pakt eerdere uitdagingen aan van de biobanking van eierstokkankerorganoïden met betrekking tot organoïdevorming en doorgangspotentieel op lange termijn en zorgt voor het genereren van volledig uitbreidbare lijnen uit de meeste solide tumorafzettingen. Het chirurgische verzamelproces van tumormonsters die worden gebruikt voor het genereren van organoïden heeft een aanzienlijke invloed op de opbrengst en het uitbreidingspotentieel. Tumorweefselmonsters kunnen worden verkregen tijdens verschillende…
The authors have nothing to disclose.
De studie wordt gefinancierd door het Duitse kankeronderzoekscentrum DKTK, partnersite München, een samenwerkingsverband tussen DKFZ en het Universitair Ziekenhuis LMU München. De studie wordt ook ondersteund door de Duitse subsidie voor kankerhulp (#70113426 en #70113433). Paraffine-inbedding van weefsel en organoïden is uitgevoerd in de Core-faciliteit van het Instituut voor Anatomie, Faculteit der Geneeskunde, LMU München, München. Confocale beeldvorming is uitgevoerd in de kernfaciliteit Bioimaging in het Biomedisch Centrum (BMC). De auteurs willen Simone Hofmann, Maria Fischer, Cornelia Herbst, Sabine Fink en Martina Rahmeh bedanken voor hun technische hulp.
100 Sterican 26 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657683 | |
100 Sterican 27 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
293T HA Rspo1-Fc | R&D systems, Minneapolis, USA | 3710-001-01 | Alternative: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111 |
A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV) | Merck, Darmstadt, Germany | 616454 | |
Advanced DMEM/F-12 Medium | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 12634028 | |
Anti-p53 antibody (DO1) | Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA | sc-126 | |
Anti-PAX8 antibody | Proteintech, Manchester, UK | 10336-1-AP | |
B-27 Supplement (50x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 17504-044 | |
Bottle-top vacuum filter 0.2 µm | Corning, Berlin, Germany | 430049 | |
CELLSTAR cell culture flask, 175 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 661175 | |
CELLSTAR cell culture flask, 25 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 690160 | |
CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 658175 | |
Collagenase I | Thermo Scientific, Waltham, USA | 17018029 | |
Costar 48-well Clear TC-treated | Corning, Berlin, Germany | 3548 | |
Cryo SFM | PromoCell – Human Centered Science, Heidelberg, Germany | C-29912 | |
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, Pathclear | R&D systems, Minneapolis, USA | 3533-005-02 | Alternative: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix Corning, 356231 |
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG | Jackson Immuno | 715-175-151 | |
DAKO Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen Retriever | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | C9999-1000ML | |
DAPI | Thermo Scientific, Waltham, USA | 62248 | |
Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Scientific, Waltham, USA | A32794 | |
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Scientific, Waltham, USA | A32814 | |
Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 14190-094 | |
Epredia Richard-Allan Scientific HistoGel | Thermo Scientific, Waltham, USA | Epredia HG-4000-012 | |
Falcon 24-well Polystyrene | Corning, Berlin, Germany | 351447 | |
Feather scalpel | Pfm medical, Cologne, Germany | 200130010 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 10270106 | |
Formalin 37% acid free, stabilized | Morphisto, Offenbach am Main, Germany | 1019205000 | |
GlutaMAX | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 35050038 | |
HEPES (1 M) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 156630080 | |
Human EpCAM/TROP-1 Antibody | R&D systems, Minneapolis, USA | AF960 | |
Human FGF10 | Peprotech, NJ, USA | 100-26 | |
Human recombinant BMP2 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHC7146 | |
Human recombinant EGF | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHG0311L | |
Human recombinant Heregulin beta-1 | Peprotech, NJ, USA | 100-03 | |
LAS X core Software | Leica Microsystems | https://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/ | |
Leica TCS SP8 X White Light Laser Confocal Microscope | Leica Microsystems | ||
N-2 Supplement (100x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 17502-048 | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | N0636 | |
Omnifix 1 mL | Braun, Melsungen, Germany | 3570519 | |
Paraffin | |||
Parafilm | Omnilab, Munich, Germany | 5170002 | |
Paraformaldehyd | Morphisto, Offenbach am Main, Germany | 1176201000 | |
Pen Strep | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 15140-122 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | P4333-100 | |
PluriStrainer 400 µm | PluriSelect, Leipzig, Germany | 43-50400-01 | |
Primocin | InvivoGen, Toulouse, France | ant-pm-05 | |
Red Blood Cell Lysing Buffer | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | 11814389001 | |
Roticlear | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | A538.5 | |
Surgipath Paraplast | Leica, Wetzlar, Germany | 39602012 | |
Thermo Scientific Nunc Cryovials | Thermo Scientific, Waltham, USA | 375418PK | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | T8787 | |
Trypan Blue Stain | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
TrypLE Express Enzyme | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 12604-013 | |
Tween-20 | PanReac AppliChem, Darmstadt, Germany | A4974-0100 | |
Y-27632 | TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany | 1254 | |
Zeocin | Invitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USA | R25001 |