Bildgebung des gesamten Bajonetts zur Visualisierung und Quantifizierung der peripheren Linsenstruktur, Zellmorphologie und -organisation
Summary
Die vorliegenden Protokolle beschreiben neuartige Whole Mount Imaging zur Visualisierung peripherer Strukturen in der Okularlinse mit Methoden zur Bildquantifizierung. Diese Protokolle können in Studien verwendet werden, um die Beziehung zwischen mikroskaligen Strukturen der Linse und der Entwicklung/Funktion der Linse besser zu verstehen.
Abstract
Die Okularlinse ist ein transparentes, flexibles Gewebe, das seine Form ändert, um Licht aus verschiedenen Entfernungen auf die Netzhaut zu fokussieren. Abgesehen von einer Basalmembran, die das Organ umgibt, der sogenannten Kapsel, ist die Linse vollständig zellulär und besteht aus einer Monoschicht von Epithelzellen auf der vorderen Hemisphäre und einer Masse von Linsenfaserzellen. Im Laufe des Lebens vermehren sich Epithelzellen in der Keimzone am Linsenäquator, und äquatoriale Epithelzellen wandern, verlängern und differenzieren sich zu neu gebildeten Faserzellen. Äquatoriale Epithelzellen verändern die Morphologie von zufällig gepackten Pflastersteinzellen in ausgerichtete sechseckige Zellen, die meridionale Reihen bilden. Neu gebildete Linsenfaserzellen behalten die hexagonale Zellform bei und verlängern sich zum vorderen und hinteren Pol hin, wodurch eine neue Hülle aus Zellen gebildet wird, die über frühere Generationen von Fasern gelegt werden. Über die Mechanismen, die die bemerkenswerte Morphogenese von Linsenepithelzellen zu Faserzellen antreiben, ist wenig bekannt. Um die Struktur, Entwicklung und Funktion von Linsen besser zu verstehen, wurden neue Bildgebungsprotokolle entwickelt, mit denen periphere Strukturen mit ganzen Okularlinsenfassungen abgebildet werden können. Hier werden Methoden zur Quantifizierung der Kapseldicke, der Epithelzellfläche, der Zellkernfläche und -form, der meridionalen Reihenzellreihenreihung und -packung sowie der Faserzellbreiten gezeigt. Diese Messungen sind unerlässlich, um die zellulären Veränderungen aufzuklären, die während des lebenslangen Linsenwachstums auftreten, und um die Veränderungen zu verstehen, die mit dem Alter oder der Pathologie auftreten.
Introduction
Die Okularlinse ist ein flexibles, transparentes Gewebe im vorderen Bereich des Auges, das Licht fein auf die Netzhaut fokussiert. Die Funktionsfähigkeit des Objektivs kann zum Teil auf seine komplizierte Architektur und Organisation zurückgeführt werden 1,2,3,4,5,6. Um das Linsengewebe herum befindet sich die Kapsel, eine Basalmembran, die für die Aufrechterhaltung der Linsenstruktur und der biomechanischen Eigenschaften unerlässlichist 7,8,9. Die Linse selbst ist vollständig zellulär und besteht aus zwei Zelltypen: Epithel- und Faserzellen. Die Epithelschicht besteht aus einer Monoschicht quaderförmiger Zellen, die die vordere Hemisphäre der Linse10 bedecken. Im Laufe des Lebens vermehren sich die Epithelzellen und wandern entlang der Linsenkapsel in Richtung Linsenäquator. Die vorderen Epithelzellen sind im Querschnitt ruhig und kopfsteingepflastert, und in der Nähe des Linsenäquators proliferieren die Epithelzellen und beginnen den Differenzierungsprozess zu neuen Faserzellen zu durchlaufen11,12. Äquatoriale Epithelzellen verwandeln sich von zufällig gepackten Zellen in organisierte meridionale Reihen mit sechseckigen Zellen. Die hexagonale Zellform wird auf der basalen Seite dieser differenzierenden Zellen beibehalten, während sich die apikale Seite am Linsendrehpunkt oder Modiolus verengt und verankert 4,13,14,15. Wenn die äquatorialen Epithelzellen beginnen, sich zu neu gebildeten Faserzellen zu verlängern, wandern die apikalen Spitzen der Zellen entlang der apikalen Oberfläche der vorderen Epithelzellen in Richtung des vorderen Pols, während sich die basalen Spitzen entlang der Linsenkapsel in Richtung des hinteren Pols bewegen. Neue Generationen von Faserzellen überlagern frühere Zellgenerationen und bilden kugelförmige Hüllen aus Fasern. Während des Zellverlängerungs- und Reifungsprozesses verändern Faserzellen ihre Morphologie erheblich 11,12,16. Diese Faserzellen bilden den Großteil der Linsenmasse 11,12,16,17,18.
Die molekularen Mechanismen, die zur Etablierung komplizierter Linsenmikrostrukturen, Zellmorphologie und einzigartiger zellulärer Organisation beitragen, sind nicht vollständig bekannt. Darüber hinaus ist der Beitrag der Linsenkapsel und der Zellstruktur zur Gesamtfunktion der Linse (Transparenz, Änderung der Linsenform) unklar. Diese Zusammenhänge werden jedoch mit Hilfe neuer bildgebender Verfahren und quantitativer Bewertungen von strukturellen und zellulären Merkmalen der Linse aufgeklärt 2,4,19,20,21,22. Es wurden neue Protokolle zur Abbildung ganzer Linsen entwickelt, die eine hochauflösende Visualisierung der Linsenkapsel, der Epithelzellen und der peripheren Faserzellen ermöglichen. Dazu gehört die Methodik zur Quantifizierung der Kapseldicke, der Zellgröße, der Zellkerngröße und -zirkularität, der meridionalen Reihenreihenfolge, der Faserzellpackung und der Faserzellbreite. Diese Visualisierungs- und Bildquantifizierungsmethoden ermöglichen eine eingehende morphometrische Untersuchung und haben Vorteile gegenüber anderen Visualisierungsmethoden (Bildgebung von flachen Halterungen oder Gewebeschnitten), da die gesamte 3D-Gewebestruktur erhalten bleibt. Diese Methoden haben es ermöglicht, neue Hypothesen zu testen und werden weitere Fortschritte im Verständnis der Entwicklung und Funktion von Linsenzellmustern ermöglichen.
Für die folgenden Experimente verwenden wir Wildtyp- und Rosa26-tdTomato-Mäuse Tandem-Dimer-Tomato (B6.129(Cg)-Gt(ROSA) (tdTomato)23 (Jackson Laboratories) im C57BL/6J-Hintergrund im Alter von 6 bis 10 Wochen beiderlei Geschlechts. Die tdTomato-Mäuse ermöglichen die Visualisierung zellulärer Plasmamembranen in lebenden Linsen durch Expression des tdTomato-Proteins, das mit den N-terminalen 8-Aminosäuren eines mutierten MARCKS-Proteins fusioniert ist, das die Plasmamembran über N-terminale Myrisylierung und interne Cystein-Palmitoylierungsstellen anspricht23. Wir verwenden auch NMIIAE1841K/E1841K Mäuse24 , die ursprünglich von Dr. Robert Adelstein (National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD) bezogen wurden. Wie bereits beschrieben, werden20 NMIIAE1841K/E1841K-Mäuse im FvBN/129SvEv/C57Bl6-Hintergrund, die einen Verlust des CP49-Kügelchen-Intermediärfilamentproteins aufweisen (die reife Faserzellmorphologie und die Biomechanik der gesamten Linse erhalten), mit C57BL6/J-Wildtyp-Mäusen rückgekreuzt. Wir untersuchten die Nachkommen auf das Vorhandensein des Wildtyp-CP49-Allels.
Die konfokale Bildgebung wurde auf einem konfokalen Laser-Scanning-Fluoreszenzmikroskop mit einer 20-fachen (NA = 0,8, Arbeitsabstand = 0,55 mm, 1-facher Zoom), einer 40-fachen (NA = 1,3 Ölobjektiv, Arbeitsabstand = 0,2 mm, 1-facher Zoom) oder einer 63-fachen (NA = 1,4 Ölobjektiv, Arbeitsabstand = 0,19 mm, 1-facher Zoom) Vergrößerung durchgeführt. Alle Bilder wurden mit einer Lochblende aufgenommen, die eine Determinante für die Dicke des optischen Querschnitts ist, bis zu 1 Airy-Einheit (die resultierenden optischen Dicken sind in den Abbildungslegenden angegeben). Die Bilder wurden mit Zen Software bearbeitet. Die Bilder wurden in .tif Format exportiert und dann in die FIJI ImageJ Software (imageJ.net) importiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die beschriebenen Protokolle ermöglichen eine hochauflösende Visualisierung von peripheren Linsenstrukturen und -zellen im vorderen und äquatorialen Bereich der Linse. In dieser Studie wurden Methoden zur Visualisierung von Linsenperipheriestrukturen mit intakten (lebenden oder festsitzenden) Linsen gezeigt, bei denen die gesamte 3D-Linsenarchitektur erhalten bleibt. Darüber hinaus wurden einfache Methoden zur morphometrischen quantitativen Analyse mit der öffentlich zugänglichen Software FIJI ImageJ bereitgestellt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch den National Eye Institute Grant R01 EY032056 an CC und R01 EY017724 an VMF sowie durch das National Institute of General Medical Sciences unter der Fördernummer P20GM139760 unterstützt. S.T.I wurde von NIH-NIGMS T32-GM133395 im Rahmen des Chemistry-Biology Interface Predoctoral Training Program und von einem University of Delaware Graduate Scholars Award unterstützt.
Materials
| 3 mm Biopsy Punch | Acuderm Inc | NC9084780 | |
| Agarose | Apex BioResearch Products | 20-102GP | |
| Antimycotic/Antibiotic | Cytiva | SV30079.01 | |
| Bovine Serum Albumin (Fraction V) | Prometheus | 25-529 | |
| Delicate task wipes | Kimwipe | ||
| Glass bottomed dish (Fluorodish) | World Precision International | FD35-100 | |
| Hoescht 33342 | Biotium | 40046 | |
| Laser scanning confocal Microscope 880 | Zeiss | ||
| MatTek Imaging Dish | MatTek Life Sciences | P35G-1.5-14 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 100503-917 | |
| PBS | GenClone | 25-507B | |
| Phenol red-free medium 199 | Gibco | 11043023 | |
| Rhodamine-Phalloidin | Thermo Fisher | 00027 | |
| Triton X100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| WGA-640 | Biotium | CF 640R |
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