Isolierung von Zellen mit morphologischen und räumlichen Informationen aus oralen submukösen Fibroseproben mittels Laser-Capture-Mikrodissektion

Summary

Die Laser-Capture-Mikrodissektion von oralem submukösem Fibrosegewebe ermöglicht die präzise Extraktion von Zellen aus histologischen Regionen von Interesse für die Analyse von Multi-Omics-Daten mit morphologischen und räumlichen Informationen.

Abstract

Die orale submuköse Fibrose (OSF) ist eine häufige Form einer potenziell bösartigen Erkrankung in der Mundhöhle. Die Atrophie des Epithels und die Fibrose der Lamina propria und der Submukosa sind häufig auf histopathologischen Objektträgern zu finden. Es wurde vorgeschlagen, dass epitheliale Dysplasie, epitheliale Atrophie und seneszente Fibroblasten mit der malignen Transformation von OSF assoziiert sind. Aufgrund der Heterogenität von potentiell malignen oralen Erkrankungen und oralen Plattenepithelkarzinomen ist es jedoch schwierig, die spezifischen molekularen Mechanismen der malignen Transformation bei OSF zu identifizieren. In dieser Arbeit stellen wir eine Methode vor, um eine kleine Anzahl von Epithel- oder Mesenchymzellen, die morphologische Daten und räumliche Informationen tragen, durch Laser-Capture-Mikrodissektion auf formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeobjektträgern zu erhalten. Mit einem Mikroskop können wir mikroskaliges (~500 Zellen) dysplastisches oder atrophisches Epithelgewebe und fibrotisches subepitheliales Gewebe präzise erfassen. Die extrahierten Zellen können durch Genom- oder Transkriptomsequenzierung ausgewertet werden, um genomische und transkriptomische Daten mit morphologischen und räumlichen Informationen zu erhalten. Dieser Ansatz beseitigt die Heterogenität der Massensequenzierung von OSF-Gewebe und die Interferenz, die durch Zellen in nicht läsionierten Bereichen verursacht wird, und ermöglicht eine präzise Spatial-Omics-Analyse von OSF-Gewebe.

Introduction

Die orale submuköse Fibrose (OSF) ist eine chronische, schleichende Erkrankung, die sich vor allem in der Wangenschleimhaut entwickelt und zu einer eingeschränkten Mundöffnung führt¹. Während OSF eine multifaktorielle Erkrankung ist, ist das Kauen von Arekanüssen oder Betelnüssen die Hauptursache für OSF ^2,3. Aufgrund dieser geographisch spezifischen Gewohnheit ist OSF überwiegend in Populationen in Südost- und Südasien konzentriert³. Zu den häufigsten histologischen Merkmalen der OSF gehören abnorme Kollagenablagerungen im Bindegewebe unter dem oralen Schleimhautepithel, Gefäßstenose und Okklusion¹. OSF-Epithelgewebe kann mit Manifestationen von Atrophie oder Hyperplasie und sogar Dysplasie auftreten, wenn es mit oraler Leukoplakie einhergeht ^4,5.

OSF wird von der Weltgesundheitsorganisation als eine häufige orale potenziell maligne Erkrankung (OPMD) definiert, die das Potenzial aufweist, zu einem oralen Plattenepithelkarzinom mit einer malignen Transformationsrate von 4%-6% fortzuschreiten6,7,8,9. Der Mechanismus, der der malignen Transformation von OSF zugrunde liegt, ist komplex¹⁰. Abnormales Wachstum des Epithels, einschließlich Dysplasie und Atrophie, erhöht das Potenzial für die Karzinogenese, und seneszente Fibroblasten im Stroma können an der malignen Progression von OSF beteiligt sein, indem sie den epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT) durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und andere Moleküle induzieren¹⁰.

Technologien für räumlich-omische Analysen generierten multi-omische Daten mit morphologischen und räumlichen Informationen, die Einblicke in Krebsmechanismen lieferten^11,12,13. In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll vor, mit dem morphologiebezogene Zellpopulationen aus formalinfixiertem, paraffineingebettetem OSF-Gewebe mittels Lasermikrodissektion erfasst werden können. Multi-omic-Analysen dieser Proben können Herausforderungen in Bezug auf die Heterogenität innerhalb des Gewebes überwinden und das Verständnis der molekularen Pathologie und der Mechanismen der malignen Transformation bei OSF¹⁴ verbessern.

Protocol

Diese Studie wurde vom institutionellen Prüfungsausschuss der Peking University School and Hospital genehmigt. Von den Patienten wurde eine Einverständniserklärung eingeholt. Die in dieser Studie verwendeten Gewebeproben wurden deidentifiziert. Das Studienschema ist in Abbildung 1 dargestellt. 1. Vorbereitung der Probe Schneiden Sie formalinfixiertes, paraffineingebettetes orales submuköses Fibrosegewebe in kontinuierliche Abschnitte…

Representative Results

Durch die Lasermikrodissektion von OSF-Geweben haben wir Proben von dysplastischem Epithel, Stroma unter dem dysplastischen Epithel, atrophischem Epithel und Stroma unter atrophischem Epithelgewebe entnommen (Abbildung 1). Durch die Extraktion von DNA und die Sequenzierung des gesamten Genoms mit geringer Tiefe waren wir in der Lage, morphologiebedingte Kopienzahlveränderungen (CNA) zu analysieren15. CNA ist eine häufige Form der genomischen Instabilität, die mit e…

Discussion

Dieses Protokoll berichtete über eine Pipeline zur Erfassung von OSF-Gewebeproben mit morphologischen und räumlichen Informationen für weitere räumlich-omische Analysen durch Lasermikrodissektion. Aus den repräsentativen Ergebnissen identifizierten wir unterschiedliche CNA-Muster in verschiedenen morphologiebezogenen Proben.

OSF, eine Form der OPMD, ist eine häufige Krebsvorstufe des oralen Plattenepithelkarzinoms⁶. Es wurde berichtet, dass genomische Instabilitä…

Materials

Adhesion microscope slides	CITOTEST	REF.188105
Div-haematoxylin	YiLi	20230326
Eosin solution	BASO	BA4098
Ethanol	PEKING REAGENT	No.32061
Harris hematoxylin dye solution	YiLi	20230326
Hot plate	LEICA	HI1220
Laser capture microdissection system	LEICA	LMD7	Machine
Laser microdissection microsystem	LEICA	8.2.3.7603	Software
Micromount mounting medium	LEICA	REF.3801731
Microscope cover glass	CITOTEST	REF.10212450C
Microtome	LEICA	RM2235
PCR tubes	AXYGEN	16421959
PEN-membrane slides	LEICA	No.11505158
Re-blue solution	YiLi	20230326
Ultrapure distilled water	Invitrogen	REF.10977-015
Xylene	PEKING REAGENT	No.33535