Isolatie van cellen met morfologische en ruimtelijke informatie uit orale submuceuze fibrosemonsters door middel van microdissectie met laseropname
Summary
Laseropname van microdissectie van orale submuceuze fibroseweefsels maakt nauwkeurige extractie van cellen mogelijk uit histologische regio’s die van belang zijn voor de analyse van multi-omics-gegevens met morfologische en ruimtelijke informatie.
Abstract
Orale submuceuze fibrose (OSF) is een veel voorkomende vorm van potentieel kwaadaardige aandoening in de mondholte. De atrofie van epitheel en fibrose van de lamina propria en de submucosa worden vaak aangetroffen op histopathologische objectglaasjes. Er werd voorgesteld dat epitheliale dysplasie, epitheliale atrofie en senescente fibroblasten geassocieerd zijn met de kwaadaardige transformatie van OSF. Vanwege de heterogeniteit van potentieel kwaadaardige orale aandoeningen en oraal plaveiselcelcarcinoom, is het echter moeilijk om de specifieke moleculaire mechanismen van kwaadaardige transformatie in OSF te identificeren. Hier presenteren we een methode om een klein aantal epitheel- of mesenchymale cellen te verkrijgen die morfologische gegevens en ruimtelijke informatie dragen door middel van microdissectie met laseropname op in formaline gefixeerde paraffine-ingebedde weefselglaasjes. Met behulp van een microscoop kunnen we op microschaal (~500 cellen) dysplastisch of atrofisch epitheelweefsel en fibrotisch subepitheliaal weefsel nauwkeurig vastleggen. De geëxtraheerde cellen kunnen worden geëvalueerd door genoom- of transcriptoomsequencing om genomische en transcriptomische gegevens met morfologische en ruimtelijke informatie te verkrijgen. Deze aanpak elimineert de heterogeniteit van de sequentiebepaling van OSF-weefsel in bulk en de interferentie veroorzaakt door cellen in niet-laesionele gebieden, waardoor nauwkeurige spatial-omics-analyse van OSF-weefsel mogelijk wordt.
Introduction
Orale submuceuze fibrose (OSF) is een chronische, verraderlijke ziekte die zich voornamelijk in het mondslijmvlies ontwikkelt en resulteert in een beperkte mondopening. Hoewel OSF een multifactoriële ziekte is, is het kauwen van arecanoten of betelnoten de belangrijkste oorzaak van OSF 2,3. Vanwege deze geografisch specifieke gewoonte is OSF voornamelijk geconcentreerd in populaties in Zuidoost- en Zuid-Azië3. De gemeenschappelijke histologische kenmerken van OSF zijn onder meer abnormale collageenafzetting in het bindweefsel onder het mondslijmvliesepitheel, vasculaire stenose en occlusie1. OSF-epitheelweefsel kan manifestaties van atrofie of hyperplasie en zelfs dysplasie vertonen wanneer het gelijktijdig wordt behandeld met orale leukoplakie 4,5.
OSF wordt door de Wereldgezondheidsorganisatie gedefinieerd als een veel voorkomende orale potentieel kwaadaardige aandoening (OPMD) die het potentieel vertoont om zich te ontwikkelen tot oraal plaveiselcelcarcinoom met een kwaadaardige transformatiesnelheid van 4%-6%6,7,8,9. Het mechanisme dat ten grondslag ligt aan de kwaadaardige transformatie van OSF is complex10. Abnormale groei van het epitheel, waaronder zowel dysplasie als atrofie, verhoogt de kans op carcinogenese, en senescente fibroblasten in het stroma kunnen betrokken zijn bij de kwaadaardige progressie van OSF door epitheliale-mesenchymale overgang (EMT) te induceren via reactieve zuurstofsoorten (ROS) en andere moleculen10.
Technologieën voor ruimtelijk-omische analyses genereerden multi-omische gegevens met morfologische en ruimtelijke informatie die inzicht hebben verschaft in kankermechanismen11,12,13. Hier presenteren we een protocol om morfologie-gerelateerde celpopulaties vast te leggen uit formaline-gefixeerd paraffine-ingebed OSF-weefsel door middel van lasermicrodissectie. Multi-omische analyses van deze monsters kunnen uitdagingen met heterogeniteit binnen het weefsel overwinnen en het begrip van de moleculaire pathologie en mechanismen van kwaadaardige transformatie in OSF14 vergroten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol rapporteerde een pijplijn om OSF-weefselmonsters vast te leggen met morfologische en ruimtelijke informatie voor verdere ruimtelijk-omische analyses door middel van lasermicrodissectie. Op basis van de representatieve resultaten identificeerden we verschillende CNA-patronen tussen verschillende morfologiegerelateerde monsters.
OSF, een type OPMD, is een veel voorkomende precancereuze aandoening van oraal plaveiselcelcarcinoom6. Er is gemeld dat genomische i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door onderzoekssubsidies van de National Nature Science Foundation of China (81671006, 81300894), CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-038), National clinical key discipline construction project (PKUSSNKP-202102), Innovation Fund for Outstanding Doctoral Candidates van het Peking University Health Science Center (BMU2022BSS001).
Materials
| Adhesion microscope slides | CITOTEST | REF.188105 | |
| Div-haematoxylin | YiLi | 20230326 | |
| Eosin solution | BASO | BA4098 | |
| Ethanol | PEKING REAGENT | No.32061 | |
| Harris hematoxylin dye solution | YiLi | 20230326 | |
| Hot plate | LEICA | HI1220 | |
| Laser capture microdissection system | LEICA | LMD7 | Machine |
| Laser microdissection microsystem | LEICA | 8.2.3.7603 | Software |
| Micromount mounting medium | LEICA | REF.3801731 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | REF.10212450C | |
| Microtome | LEICA | RM2235 | |
| PCR tubes | AXYGEN | 16421959 | |
| PEN-membrane slides | LEICA | No.11505158 | |
| Re-blue solution | YiLi | 20230326 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | REF.10977-015 | |
| Xylene | PEKING REAGENT | No.33535 |
References
- Cai, X., et al. Oral submucous fibrosis: A clinicopathological study of 674 cases in China. Journal of Oral Pathology & Medicine. 48 (4), 321-325 (2019).
- Cai, X., Huang, J. Clinicopathological factors associated with progression of oral submucous fibrosis: A population-based retrospective study. Oral Oncology. 130, 105949 (2022).
- Ray, J. G., Chatterjee, R., Chaudhuri, K. Oral submucous fibrosis: A global challenge. Rising incidence, risk factors, management, and research priorities. Periodontology 2000. 80 (1), 200-212 (2019).
- Shih, Y. H., Wang, T. H., Shieh, T. M., Tseng, Y. H. Oral submucous fibrosis: A Review on etiopathogenesis, diagnosis, and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 2940 (2019).
- Cai, X., et al. The preliminary exploration of immune microenvironment in oral leukoplakia concomitant with oral submucosal fibrosis: A comparative immunohistochemical study. Journal of Oral Pathology & Medicine. , (2023).
- Warnakulasuriya, S., et al. Oral potentially malignant disorders: A consensus report from an international seminar on nomenclature and classification, convened by the WHO Collaborating Centre for Oral Cancer. Oral Diseases. 27 (8), 1862-1880 (2021).
- Cai, X., et al. Development and validation of a nomogram prediction model for malignant transformation of oral potentially malignant disorders. Oral Oncology. 123, 105619 (2021).
- Murthy, V., et al. Malignant transformation rate of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis. Journal of Clinical Medicine. 11 (7), 1793 (2022).
- Kujan, O., Mello, F. W., Warnakulasuriya, S. Malignant transformation of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis. Oral Diseases. 27 (8), 1936-1946 (2020).
- Qin, X., Ning, Y., Zhou, L., Zhu, Y. Oral submucous fibrosis: Etiological mechanism, malignant transformation, therapeutic approaches and targets. International Journal of Molecular Sciences. 24 (5), 4992 (2023).
- Sun, L., et al. Single-cell and spatial dissection of precancerous lesions underlying the initiation process of oral squamous cell carcinoma. Cell Discovery. 9 (1), 28 (2023).
- Zhu, J., et al. Delineating the dynamic evolution from preneoplasia to invasive lung adenocarcinoma by integrating single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics. Experimental & Molecular Medicine. 54 (11), 2060-2076 (2022).
- Ji, A. L., et al. Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma. Cell. 182 (2), 497-514 (2020).
- Van den Bossche, V., et al. Microenvironment-driven intratumoral heterogeneity in head and neck cancers: clinical challenges and opportunities for precision medicine. Drug Resistance Updates. 60, 100806 (2022).
- Li, X., et al. Improvement in the risk assessment of oral leukoplakia through morphology-related copy number analysis. Science China. Life sciences. 64 (9), 1379-1391 (2021).
- Watkins, T. B. K., et al. Pervasive chromosomal instability and karyotype order in tumour evolution. Nature. 587 (7832), 126-132 (2020).
- Odell, E. W. Aneuploidy and loss of heterozygosity as risk markers for malignant transformation in oral mucosa. Oral Diseases. 27 (8), 1993-2007 (2021).
- Wood, H. M., et al. The genomic road to invasion-examining the similarities and differences in the genomes of associated oral pre-cancer and cancer samples. Genome Medicine. 9 (1), 53 (2017).
- Venugopal, D. C., et al. Integrated proteomics based on 2D gel electrophoresis and mass spectrometry with validations: Identification of a biomarker compendium for oral submucous fibrosis-An indian study. Journal of Personalized Medicine. 12 (2), 208 (2022).
- Kundu, P., Pant, I., Jain, R., Rao, S. G., Kondaiah, P. Genome-wide DNA methylation changes in oral submucous fibrosis. Oral Diseases. 28 (4), 1094-1103 (2022).
- Cai, X., Zhang, H., Li, T. Multi-target pharmacological mechanisms of Salvia miltiorrhiza against oral submucous fibrosis: A network pharmacology approach. Archives of Oral Biology. 126, 105131 (2021).
- Xiao, X., Hu, Y., Li, C., Shi, L., Liu, W. DNA content abnormality in oral submucous fibrosis concomitant leukoplakia: A preliminary evaluation of the diagnostic and clinical implications. Diagnostic Cytopathology. 48 (11), 1111-1114 (2020).
- Zhou, S., et al. Long non-coding RNA expression profile associated with malignant progression of oral submucous fibrosis. Journal of Oncology. 2019, 6835176 (2019).
- Lunde, M. L., et al. Profiling of chromosomal changes in potentially malignant and malignant oral mucosal lesions from South and Southeast Asia using array-comparative genomic hybridization. Cancer Genomics & Proteomics. 11 (3), 127-140 (2014).
- Sun, C., et al. Spatially resolved metabolomics to discover tumor-associated metabolic alterations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (1), 52-57 (2019).
- Ma, M., et al. Copy number alteration profiling facilitates differential diagnosis between ossifying fibroma and fibrous dysplasia of the jaws. International Journal of Oral Science. 13 (1), 21 (2021).
