Tot op heden zijn protocollen voor de gelijktijdige isolatie van alle belangrijke celtypen van het centrale zenuwstelsel uit dezelfde muis een onvervulde vraag. Het protocol toont een procedure die toepasbaar is bij naïeve en experimentele auto-immuun encefalomyelitis-muizen om complexe cellulaire netwerken tijdens neuro-inflammatie te onderzoeken en tegelijkertijd het vereiste aantal muizen te verminderen.
Experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) is het meest voorkomende muizenmodel voor multiple sclerose (MS) en wordt vaak gebruikt om de nog onbekende etiologie van MS verder op te helderen om nieuwe behandelingsstrategieën te ontwikkelen. Het myeline-oligodendrocytglycoproteïnepeptide 35-55 (MOG35-55) EAE-model reproduceert een zelfbeperkend monofasisch ziekteverloop met oplopende verlamming binnen 10 dagen na immunisatie. De muizen worden dagelijks onderzocht met behulp van een klinisch scoresysteem. MS wordt aangedreven door verschillende pathomechanismen met een specifiek temporeel patroon, dus het onderzoek naar de rol van celtypes van het centrale zenuwstelsel (CZS) tijdens de progressie van de ziekte is van groot belang. Het unieke kenmerk van dit protocol is de gelijktijdige isolatie van alle belangrijke celtypen van het CZS (microglia, oligodendrocyten, astrocyten en neuronen) die van toepassing zijn op volwassen EAE en gezonde muizen. De dissociatie van de hersenen en het ruggenmerg van volwassen muizen wordt gevolgd door magnetisch geactiveerde celsortering (MACS) om microglia, oligodendrocyten, astrocyten en neuronen te isoleren. Flowcytometrie werd gebruikt om kwaliteitsanalyses uit te voeren van de gezuiverde eencellige suspensies, waarbij de levensvatbaarheid na celisolatie werd bevestigd en de zuiverheid van elk celtype van ongeveer 90% werd aangegeven. Kortom, dit protocol biedt een nauwkeurige en uitgebreide manier om complexe cellulaire netwerken in gezonde en EAE-muizen te analyseren. Bovendien kan het aantal benodigde muizen aanzienlijk worden verminderd, omdat alle vier de celtypen uit dezelfde muizen worden geïsoleerd.
Multiple sclerose (MS) is een chronische inflammatoire auto-immuunziekte van het centrale zenuwstelsel (CZS) die wordt gekenmerkt door demyelinisatie, axonale schade, gliose en neurodegeneratie. Ondanks talrijke onderzoeksbenaderingen op dit gebied, wordt de pathofysiologie van MS nog steeds niet volledig begrepen 1,2,3,4. Het meest voorkomende diermodel voor het onderzoeken van MS is de myeline-oligodendrocytglycoproteïnepeptide 35-55 (MOG35-55)-geïnduceerde experimentele auto-immuunencefalomyelitis (EAE) die veel van zijn klinische en pathofysiologische kenmerken deelt 5,6,7,8,9 . Het is gebaseerd op de reactie van het immuunsysteem tegen CZS-specifieke antigenen die leiden tot ontsteking, demyelinisatie en neuroaxonale degeneratie. Experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) is een geschikt model voor het onderzoek van neuro-inflammatoire routes en signaalcascades die bij MS worden aangetroffen.
De huidige therapiemogelijkheden voor MS zijn slechts gedeeltelijk effectief en richten zich voornamelijk op de initiële ontstekingsfase van de ziekte. De neurodegeneratieve component van MS lijkt echter de grootste uitdaging te zijn voor therapeutische benaderingen op lange termijn. Daarom zijn reproduceerbare en nauwkeurige celisolatieprotocollen nodig om moleculaire en cellulaire mechanismen bij auto-immuunziekten op een alomvattende manier te onderzoeken. Zelfs als er enkele protocollen voor de isolatie van één enkel celtype bestaan 10,11,12,13,14,15, is er een onvervulde behoefte aan de gelijktijdige isolatie van verschillende CZS-residente celpopulaties tegelijk. Eerdere protocollen voor de isolatie van CZS-residente cellen missen het behoud van cellulaire functionaliteit en zuiverheid, wat resulteert in co-cultivatie met naburige cellen 16,17,18 of de ongeschiktheid voor complexe analyses van intracellulaire netwerken ex vivo19,20,21,22.
Het doel van dit protocol was om een reproduceerbare en alomvattende methode vast te stellen voor de gelijktijdige isolatie van zuivere levensvatbare eencellige suspensies van alle belangrijke CZS-residente celtypen die toepasbaar zijn bij volwassen gezonde en EAE-muizen. De verschillende celtypen werden geïsoleerd met behulp van magnetisch geactiveerde celsortering (MACS)23. De celscheiding kan worden bereikt door positieve selectie, d.w.z. magnetische etikettering van celtype-specifieke oppervlaktemarkers, of door negatieve selectie via biotinylering en uitputting van alle ongewenste cellen. Flowcytometrie werd toegepast om een zuiverheid van meer dan 90% en een levensvatbaarheid van ten minste 80% van de geïsoleerde eencellige suspensies te garanderen.
Concluderend was het belangrijkste doel om een protocol op te stellen voor de gelijktijdige isolatie van alle belangrijke CZS-residente celtypen als een veelzijdig hulpmiddel voor het onderzoek van neuro-inflammatoire routes die een uitgebreide en nauwkeurige analyse bieden van complexe cellulaire netwerken en biochemische signaleringscascades in gezonde en EAE-muizen.
Tot nu toe bieden methoden om in het CZS wonende cellen ex vivo in kaart te brengen door massaspectrometrie en RNA-sequencing te combineren, een zeer nauwkeurige cellulaire profilering op het gebied van gezondheid en ziekte, maar vereisen ambitieuze technische kennis en expertise op dit gebied50,51. Verder staan ze geen functionele analyses toe en zijn ze erg duur. Daarnaast bieden microfluïdische brain-on-a-chip-systemen een snelle en betaalbare screening op ziektemechanismen en het testen van nieuwe therapeutische benaderingen met de beperking van celgroei en migratie 52,53,54,55. CZS-organoïden zouden in de toekomst ook een gelijkwaardig alternatief kunnen zijn voor het onderzoek naar cellulaire modellering, intercellulaire verbindingen en interacties tijdens ziekteverloop 56,57,58,59. Fluorescentie- en magnetisch geactiveerde celsortering zijn momenteel echter de meest effectieve methoden om zuivere en levensvatbare eencellige suspensies ex vivo 35,60,61 te genereren. Zelfs als andere gevestigde productieprotocollen voor de isolatie van CZS-residente celtypen vergelijkbaar zijn met betrekking tot de afzonderlijke stappen van de magnetische isolatie en de voorafgaande celdissociatie, zijn ze bedoeld om voor elk celtype afzonderlijk te worden uitgevoerd. Daarentegen integreert het huidige protocol verschillende isolatiemethoden voor elk CZS-resident-celtype in een logische context, zodat ze tegelijkertijd en vanuit één enkele CZS-celsuspensie kunnen worden uitgevoerd (Tabel 1, Tabel 2). Het maakt dus multi-omics-analyses mogelijk van één enkele CZS-celsuspensie en, uiteindelijk, de verkenning van complexe neuronale netwerken. Ook al is het geen must om meerdere weefsels van meerdere dieren samen te voegen om dit protocol uit te voeren, deze pooling zorgt voor een voldoende aantal geïsoleerde cellen voor verdere stroomafwaartse analyse. Het gebruik van verschillende muizen voor de isolatie van de afzonderlijke celtypen zou de mogelijkheid uitsluiten om potentiële cellulaire interacties te analyseren. Daarnaast bespaart het combineren van individuele isolatiemethoden voor de verschillende CZS-celtypen, die allemaal een eerdere CZS-dissociatie volgen, materiaalkosten door één gedissocieerde CZS-celsuspensie te gebruiken voor alle volgende magnetische isolatiestappen. Bovendien wordt een mogelijke technische vooringenomenheid veroorzaakt door het gebruik van verschillende muizen geminimaliseerd.
Een beperking van het protocol zou het bijna exclusieve gebruik van vrouwelijke C57BL/6J-muizen kunnen zijn. Het EAE-immunisatieprotocol is ontworpen en vastgesteld voor vrouwelijke muizen, dus dit celisolatieprotocol werd ook geïmplementeerd in vrouwelijke C57BL/6J-muizen. Desalniettemin werden tijdens de ontwikkeling van dit protocol ook naïeve mannelijke muizen gebruikt, zonder enig effect op het resulterende celaantal of de zuiverheid te herkennen. Een andere beperking beïnvloedt de magnetische celisolatie van neuronen, aangezien er geen specifieke microkorrels bestaan voor de isolatie van neuronen in termen van een positieve selectie. Er werd verondersteld dat een zuivere eencellige suspensie kon worden verkregen via biotine-etikettering en uitputting van alle niet-neuronale cellen (tabel 2). Deze veronderstelling werd geverifieerd door het gebruik van NeuN als een specifieke nucleaire marker voor neuronen, geïntegreerd in het genoemde zuiverheidspaneel voor flowcytometrie. Een andere beperking betreft de isolatie van microglia in EAE-muizen. Hier worden de resulterende celopbrengsten verlaagd in vergelijking met de andere celtypen vanwege de extra sorteerstap na het MACS-protocol. Bovendien zou je kunnen stellen dat sorteren de mechanische belasting van de microglia verhoogt in vergelijking met de andere celpopulaties. Individuele sorteerstrategieën kunnen leiden tot verschillende hoeveelheden celopbrengsten. Als het aantal geïsoleerde cellen minder is dan verwacht of gewenst, wordt aanbevolen om de poortopstelling aan te passen en/of de onderscheid tussen levend en dood te verbeteren.
Een cruciale stap in het protocol is het verwijderen van puin. De gradiënt moet heel langzaam en voorzichtig worden gelaagd om de drie gewenste afzonderlijke fasen te creëren (Figuur 2A). Alleen als de myeline- en andere puinresten in de twee bovenste fasen volledig worden verwijderd (figuur 2E), kunnen zuivere eencellige suspensies worden gegenereerd en kan verdere verontreiniging worden verminderd. Als de resulterende celsuspensies niet zuiver zijn, is dit waarschijnlijk het deel van het protocol dat als eerste moet worden verbeterd, naast de zekerheid van het juiste gebruik van alle microkorrels.
Het verkrijgen van hoge niveaus van zuiverheid en levensvatbaarheid kan een uitdaging zijn in dit soort experimenten. Enkele aanbevelingen voor het oplossen van problemen zijn:
-Werken onder steriele omstandigheden is verplicht om besmetting van de verschillende microbolletjes te voorkomen en herhaald gebruik mogelijk te maken, vooral voor latere teelt.
-Etikettering van elke buis om verwisseling te voorkomen, wordt ten zeerste aanbevolen.
-Vermijd het gebruik van ongekoelde reagentia/buffers. Bewaar alle celsuspensies tijdens het hele experiment op ijs om een hoge levensvatbaarheid te garanderen.
-Houd de tijd tussen de verschillende werkstappen zo kort mogelijk. Er is geen specifiek onderdeel in het protocol waar het pauzeren van het experiment wordt aanbevolen.
-Het is zeer relevant om zich aan de gespecificeerde incubatietijden te houden.
Concluderend biedt dit huidige protocol voor de gelijktijdige isolatie van alle belangrijke CZS-residente celtypen uit één CZS-replicaat de mogelijkheid om complexe neuronale netwerken en neuro-inflammatoire routes ex vivo te analyseren vanuit één CZS-celsuspensie. Zo kunnen CZS-residente cellen worden onderzocht tijdens verschillende stadia van ziekteverloop, bijvoorbeeld tijdens neuro-inflammatie, neurodegeneratie en/of remissie bij EAE. Bovendien kunnen cel-celinteracties en biochemische routes op individueel niveau worden bestudeerd en kan de variabiliteit binnen experimentele groepen worden verminderd. Er is ook de mogelijkheid om fracties van de geïsoleerde CZS-cellen in monoculturen te kweken voor verdere functionele tests en validatie. Al met al biedt dit protocol aanzienlijke vooruitgang die mogelijk van invloed is op preklinische en klinische onderzoeksbenaderingen.
The authors have nothing to disclose.
De figuren zijn gemaakt met Adobe Illustrator (versie 2023) en Servier Medical Art (https://smart.servier.com). Antonia Henes werd ondersteund door de Jürgen Manchot Stiftung.
70 μm cell strainers | Corning, MA, USA | 352350 | CNS tissue dissociation |
ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE-Vio 615 (clone REA-969) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-116-244 | Flow cytometry, store at 4 °C |
Adult Brain Dissociation Kit, mouse, and rat | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-107-677 | Tissue dissociation,contains debris and red blood cell removal solutions; prepare aliquots of enzyme A and P upon arrival and store them at -20 °C; store the remaining kit at 4 °C |
Anti-ACSA-2 MicroBead Kit, mouse | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-097-678 | MACS of astrocytes, store at 4 °C |
Anti-mouse CD16/32 antibody | BioLegend, London, UK | 101301 | Flow cytometry, store at 4 °C |
Anti-O4 MicroBeads, human, mouse, rat | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-094-543 | MACS of oligodendrocytes, store at 4 °C |
AstroMACS Separation buffer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-091-221 | MACS of astrocytes, store at 4 °C |
Biotin Antibody, PE (clone Bio3-18E7) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-113-853 | Flow cytometry, store at 4 °C |
BRAND Neubauer counting chamber | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 10195580 | Cell counting |
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD45 Antibody (clone 30-F11) | BioLegend, London, UK | 103137 | Flow cytometry, store at 4 °C |
CD11b MicroBeads, human, mouse | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-049-601 | MACS of microglia, store at 4 °C |
DNAse I, recombinant, Rnase-free | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 4716728001 | Flow cytometry, store at -20° C |
D-PBS with Calcium, Magnesium, Glucose, Pyruvat | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 14287080 | Buffer, store at 4 °C |
D-PBS, without calcium, without magnesium | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 14190250 | Buffer, store at 4 °C |
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 65-0865-14 | Flow cytometry, store at 4 °C |
eBioscience Foxp3/Transcription factor staining buffer set | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 00-5523-00 | Flow cytometry, store at 4°C |
Falcon (15 mL) | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 11507411 | Cell tube |
Falcon (50 mL) | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 10788561 | Cell tube |
Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 08-771-23 | Flow cytometry |
FcR Blocking Reagent, mouse | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-092-575 | MACS of oligodendrocytes, store at 4 °C |
Female C57BL/6J mice | Charles River Laboratories, Sulzfeld, Germany | Active EAE induction | |
Fetal calf serum (FCS) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | F2442-50ML | Flow cytometry, store at -5 to -20 °C |
FITC Rat Anti-CD 11b (clone M1/70) | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 553310 | Flow cytometry, store at 4 °C |
Freund’s Complete adjuvant | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | AR001 | Active EAE induction, store at 4 °C |
GentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-093-237 | CNS tissue dissociation |
GentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-096-427 | CNS tissue dissociation |
Graphpad Prism 8.4.3 | Graphpad by Dotmatics | Graphical Analysis | |
Isoflurane | AbbVie, North Chicago, IL, USA | Active EAE induction, store at 4 °C | |
Kaluza Analysis Software V2.1.1 | Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA | Flow cytometry analysis | |
LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-042-401 | MACS |
MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-091-376 | PB-buffer |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-042-303 | MACS |
MOG35–55 peptide | Charité, Berlin, Germany; alternatives: Genosphere Biotechnologies (Paris, France) or sb-Peptide (Saint Egrève, France) | Active EAE induction, store at -20 °C | |
Mycobacterium tuberculosis strain H37 Ra | Becton, Dickinson and Company (BD),Franklin Lakes, NJ, USA | Active EAE induction, store at 4 °C | |
Neuron Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-115-390 | MACS of neurons, store at 4 °C |
O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC, (clone REA-576) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-119-897 | Flow cytometry, store at 4 °C |
Pertussis toxin in glycerol | Hooke Laboratories Inc., Lawrence, MA, USA | BT-0105 | Active EAE induction; store at -20 °C |
pluriStrainer Mini 100 μm | pluriSelect Life Science UG, Leipzig, Sachsen, Germany | 43-10100-40 | Flow cytometry |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-090-976 | MACS |
Recombinant Alexa Fluor 647 Anti-NeuN antibody (clone EPR12763) | Abcam, Cambridge, UK | EPR12763 | Flow cytometry, store at -20 °C |
Stainless Steel Brain Matrices, 1 mm | Ted Pella, Redding, CA, USA | 15067 | CNS tissue dissection |
Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 15250061 | Cell counting |
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 15575020 | Flow cytometry, store at room temperature |