迄今为止,从同一只小鼠中同时分离所有主要中枢神经系统驻留细胞类型的方案尚未满足需求。该方案显示了适用于幼稚和实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的程序,以研究神经炎症期间的复杂细胞网络,同时减少所需的小鼠数量。
实验性自身免疫性脑脊髓炎 (EAE) 是多发性硬化症 (MS) 最常见的小鼠模型,经常用于进一步阐明 MS 的未知病因,以开发新的治疗策略。髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽 35-55 (MOG35-55) EAE 模型再现免疫后 10 天内伴有上行麻痹的自限性单相病程。每天使用临床评分系统检查小鼠。多发性硬化症由具有特定时间模式的不同病理机制驱动,因此研究中枢神经系统 (CNS) 驻留细胞类型在疾病进展过程中的作用非常有意义。该协议的独特之处在于同时分离适用于成年EAE和健康小鼠的所有主要CNS驻留细胞类型(小胶质细胞,少突胶质细胞,星形胶质细胞和神经元)。从成年小鼠中分离大脑和脊髓后,进行磁活化细胞分选 (MACS) 以分离小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞和神经元。流式细胞术用于对纯化的单细胞悬液进行质量分析,确认细胞分离后的活力,并表明每种细胞类型的纯度约为 90%。总之,该协议提供了一种精确而全面的方法来分析健康和EAE小鼠中的复杂细胞网络。此外,由于所有四种细胞类型都是从同一只小鼠中分离出来的,因此所需的小鼠数量可以大大减少。
多发性硬化症 (MS) 是一种中枢神经系统 (CNS) 的慢性炎症性自身免疫性疾病,其特征是脱髓鞘、轴突损伤、神经胶质增生和神经退行性变。尽管该领域有许多研究方法,但 MS 的病理生理学仍未完全了解 1,2,3,4。研究 MS 的最常见动物模型是髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽 35-55 (MOG35-55) 诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎 (EAE),它具有许多临床和病理生理特征 5,6,7,8,9 .它基于免疫系统对导致炎症、脱髓鞘和神经轴突变性的中枢神经系统特异性抗原的反应。实验性自身免疫性脑脊髓炎 (EAE) 是研究 MS 中发现的神经炎症通路和信号级联反应的合适模型。
目前多发性硬化症的治疗方案仅部分有效,主要集中在疾病的初始炎症阶段。然而,多发性硬化症的神经退行性成分似乎是长期治疗方法的主要挑战。因此,需要可重复和精确的细胞分离方案来全面研究自身免疫性疾病的分子和细胞机制。即使存在一些用于分离一种单一细胞类型的方案10,11,12,13,14,15,同时分离多个CNS驻留细胞群的需求仍未得到满足。先前用于分离中枢神经系统驻留细胞的方案缺乏保留细胞功能和纯度的方案,导致与相邻细胞共培养16,17,18或不适合离体细胞内网络的复杂分析19,20,21,22。
该方案的目的是建立一种可重复和全面的方法,用于同时分离适用于成年健康和EAE小鼠的所有主要CNS驻留细胞类型的纯活单细胞悬浮液。使用磁活化细胞分选 (MACS) 23 分离不同的细胞类型。细胞分离可以通过阳性选择(即细胞类型特异性表面标记物的磁性标记)或通过生物素化和所有不需要的细胞的耗竭进行阴性选择来实现。应用流式细胞术以确保纯度高于 90% 和至少 80% 的分离单细胞悬浮液的活力。
总之,主要目标是建立一种同时分离所有主要中枢神经系统驻留细胞类型的方案,作为研究神经炎症途径的多功能工具,提供对复杂细胞网络和生化信号级联的全面精确分析健康和EAE小鼠。
到目前为止,通过结合质谱法和 RNA 测序来绘制 CNS 驻留细胞离体的方法在健康和疾病中提供了非常精确的细胞谱分析,但需要该领域雄心勃勃的技术知识和专业知识50,51。此外,它们不允许进行泛函分析,并且非常昂贵。除此之外,微流控脑芯片系统为疾病机制提供了快速且经济实惠的筛选,并测试了限制细胞生长和迁移的新治疗方法52,53,54,55。CNS类器官也可能在未来代表一种等效的替代方案,用于研究疾病过程中的细胞建模、细胞间连接和相互作用56,57,58,59。然而,荧光和磁激活细胞分选是目前产生纯和活单细胞悬浮液的最有效方法35,60,61。即使其他已建立的用于分离 CNS 驻留细胞类型的制造方案在磁隔离和先前细胞解离的各个步骤方面相似,它们也旨在针对每种细胞类型单独执行。相比之下,目前的方案将每种 CNS 驻留细胞类型的不同分离方法集成到逻辑上下文中,以便它们可以同时从一个单个 CNS 细胞悬液中执行(表 1、表 2)。因此,它能够从单个CNS细胞悬液进行多组学分析,并最终探索复杂的神经元网络。即使不需要混合来自多个动物的多个组织来执行该方案,这种合并也确保了足够数量的分离细胞用于进一步的下游分析。使用不同的小鼠来分离单细胞类型将排除分析潜在细胞相互作用的可能性。除此之外,将不同中枢神经系统细胞类型的单独分离方法(均遵循先前的中枢神经系统解离)相结合,通过将一种解离的中枢神经系统细胞悬浮液用于所有后续磁性分离步骤,可以节省材料成本。此外,由于使用不同的鼠标而引起的潜在技术偏差被最小化。
该协议的一个局限性可能是几乎完全使用雌性C57BL / 6J小鼠。EAE免疫方案是针对雌性小鼠设计和建立的,因此该细胞分离方案也在雌性C57BL / 6J小鼠中实施。然而,在该方案的开发过程中也使用了幼稚的雄性小鼠,没有认识到对所得细胞数量或纯度的任何影响。另一个限制会影响神经元的磁性细胞分离,因为在正选择方面不存在用于分离神经元的特定微珠。假设可以通过生物素标记和所有非神经元细胞的耗竭获得纯单细胞悬浮液(表2)。通过使用 NeuN 作为神经元的特异性核标记物来验证这一假设,该标记物集成在上述流式细胞术纯度面板中。另一个局限性涉及EAE小鼠中小胶质细胞的分离。在这里,与其他细胞类型相比,由于MACS协议之后的额外分选步骤,产生的细胞产量降低。此外,有人可能会争辩说,与其他细胞群相比,分选增加了小胶质细胞的机械应力。单独的分选策略可能导致不同数量的细胞产量。如果分离的细胞数量小于预期或期望,建议调整门控设置和/或改进活/死区分。
协议中的一个关键步骤是清除碎片。梯度必须非常缓慢而温和地分层,以创建三个想要的独立相(图2A)。只有当两个顶相中的髓鞘和其他碎片残留物被完全去除(图2E),才能产生纯单细胞悬浮液,并减少进一步的污染。如果得到的细胞悬浮液缺乏纯度,这可能是方案中应该首先改进的部分,其次是保证所有微珠的正确使用。
在这种类型的实验中,获得高水平的纯度和活力可能具有挑战性。一些故障排除建议包括:
-必须在无菌条件下工作,以防止不同微珠的污染,并允许重复使用,特别是用于后续培养。
-强烈建议在每根管子上贴上标签以防止混淆。
-避免使用未冷却的试剂/缓冲液。在整个实验过程中,将所有细胞悬浮液储存在冰上,以确保高活力。
-保持不同工作步骤之间的时间尽可能短。协议中没有建议暂停实验的特定部分。
-遵守规定的潜伏期非常重要。
总之,目前从一次中枢神经系统复制中同时分离所有主要中枢神经系统驻留细胞类型的方案提供了从一次中枢神经系统细胞悬浮液中分析复杂神经元网络和神经炎症途径 的可能性 。因此,可以在病程的不同阶段研究驻留中枢神经系统细胞,例如,在 EAE 的神经炎症、神经退行性和/或缓解期间。此外,可以在个体水平上研究细胞间相互作用和生化途径,并且可以减少实验组内的变异性。还有机会在单一培养物中培养分离的中枢神经系统细胞的组分,以进行进一步的功能测定和验证。总而言之,该协议提供了可能影响临床前和临床研究方法的重大进展。
The authors have nothing to disclose.
人物是使用 Adobe Illustrator(2023 版)和 Servier Medical Art (https://smart.servier.com)创建的。安东尼娅·赫内斯(Antonia Henes)得到了于尔根·曼肖基金会(Jürgen Manchot Stiftung)的支持。
70 μm cell strainers | Corning, MA, USA | 352350 | CNS tissue dissociation |
ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE-Vio 615 (clone REA-969) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-116-244 | Flow cytometry, store at 4 °C |
Adult Brain Dissociation Kit, mouse, and rat | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-107-677 | Tissue dissociation,contains debris and red blood cell removal solutions; prepare aliquots of enzyme A and P upon arrival and store them at -20 °C; store the remaining kit at 4 °C |
Anti-ACSA-2 MicroBead Kit, mouse | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-097-678 | MACS of astrocytes, store at 4 °C |
Anti-mouse CD16/32 antibody | BioLegend, London, UK | 101301 | Flow cytometry, store at 4 °C |
Anti-O4 MicroBeads, human, mouse, rat | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-094-543 | MACS of oligodendrocytes, store at 4 °C |
AstroMACS Separation buffer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-091-221 | MACS of astrocytes, store at 4 °C |
Biotin Antibody, PE (clone Bio3-18E7) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-113-853 | Flow cytometry, store at 4 °C |
BRAND Neubauer counting chamber | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 10195580 | Cell counting |
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD45 Antibody (clone 30-F11) | BioLegend, London, UK | 103137 | Flow cytometry, store at 4 °C |
CD11b MicroBeads, human, mouse | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-049-601 | MACS of microglia, store at 4 °C |
DNAse I, recombinant, Rnase-free | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 4716728001 | Flow cytometry, store at -20° C |
D-PBS with Calcium, Magnesium, Glucose, Pyruvat | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 14287080 | Buffer, store at 4 °C |
D-PBS, without calcium, without magnesium | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 14190250 | Buffer, store at 4 °C |
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 65-0865-14 | Flow cytometry, store at 4 °C |
eBioscience Foxp3/Transcription factor staining buffer set | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 00-5523-00 | Flow cytometry, store at 4°C |
Falcon (15 mL) | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 11507411 | Cell tube |
Falcon (50 mL) | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 10788561 | Cell tube |
Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 08-771-23 | Flow cytometry |
FcR Blocking Reagent, mouse | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-092-575 | MACS of oligodendrocytes, store at 4 °C |
Female C57BL/6J mice | Charles River Laboratories, Sulzfeld, Germany | Active EAE induction | |
Fetal calf serum (FCS) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | F2442-50ML | Flow cytometry, store at -5 to -20 °C |
FITC Rat Anti-CD 11b (clone M1/70) | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 553310 | Flow cytometry, store at 4 °C |
Freund’s Complete adjuvant | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | AR001 | Active EAE induction, store at 4 °C |
GentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-093-237 | CNS tissue dissociation |
GentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-096-427 | CNS tissue dissociation |
Graphpad Prism 8.4.3 | Graphpad by Dotmatics | Graphical Analysis | |
Isoflurane | AbbVie, North Chicago, IL, USA | Active EAE induction, store at 4 °C | |
Kaluza Analysis Software V2.1.1 | Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA | Flow cytometry analysis | |
LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-042-401 | MACS |
MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-091-376 | PB-buffer |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-042-303 | MACS |
MOG35–55 peptide | Charité, Berlin, Germany; alternatives: Genosphere Biotechnologies (Paris, France) or sb-Peptide (Saint Egrève, France) | Active EAE induction, store at -20 °C | |
Mycobacterium tuberculosis strain H37 Ra | Becton, Dickinson and Company (BD),Franklin Lakes, NJ, USA | Active EAE induction, store at 4 °C | |
Neuron Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-115-390 | MACS of neurons, store at 4 °C |
O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC, (clone REA-576) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-119-897 | Flow cytometry, store at 4 °C |
Pertussis toxin in glycerol | Hooke Laboratories Inc., Lawrence, MA, USA | BT-0105 | Active EAE induction; store at -20 °C |
pluriStrainer Mini 100 μm | pluriSelect Life Science UG, Leipzig, Sachsen, Germany | 43-10100-40 | Flow cytometry |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-090-976 | MACS |
Recombinant Alexa Fluor 647 Anti-NeuN antibody (clone EPR12763) | Abcam, Cambridge, UK | EPR12763 | Flow cytometry, store at -20 °C |
Stainless Steel Brain Matrices, 1 mm | Ted Pella, Redding, CA, USA | 15067 | CNS tissue dissection |
Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 15250061 | Cell counting |
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 15575020 | Flow cytometry, store at room temperature |