Экстракция внеклеточной ДНК образцов стекловидного тела и водянистой влаги для диагностики и мониторинга витреоретинальной лимфомы
Summary
Здесь налажена процедура извлечения внеклеточной ДНК из стекловидного тела и водянистой влаги для проведения молекулярных исследований для диагностики витреоретинальной лимфомы. Метод позволяет одновременно извлекать ДНК из клеточного компонента образца или резервировать ее для вспомогательного тестирования.
Abstract
Витреоретинальная лимфома (VRL) представляет собой агрессивную лимфому, часто классифицируемую как первичная диффузная В-крупноклеточная лимфома центральной нервной системы. Для диагностики VRL собираются такие образцы, как стекловидное тело и, в последнее время, водянистая влага. Диагностическое тестирование этих образцов на VRL включает цитологию, проточную цитометрию и молекулярное тестирование. Тем не менее, как цитопатология, так и проточная цитометрия, наряду с молекулярным тестированием с использованием клеточной ДНК, требуют неповрежденных цельных клеток. Проблема заключается в том, что стекловидное тело и водянистая влага, как правило, имеют низкую клеточность, и многие клетки разрушаются во время сбора, хранения и обработки. Кроме того, эти образцы представляют дополнительные трудности для молекулярного тестирования из-за высокой вязкости стекловидного тела и малого объема как стекловидного, так и водянистого влаги. В данном исследовании предложен метод извлечения внеклеточной ДНК из стекловидных и водных образцов. Этот подход дополняет выделение клеточной ДНК или позволяет использовать клеточный компонент этих образцов для других методов диагностики, включая цитологию и проточную цитометрию.
Introduction
Витреоретинальная лимфома (VRL) – агрессивная лимфома, ассоциированная с первичной диффузной В-крупноклеточной лимфомой 1,2,3 в центральной нервной системе. VRL обычно приводит к летальному исходу из-за поражения центральной нервной системы 1,2. Несмотря на редкость1,4, VRL часто проявляется симптомами, сходными с задним увеитом и другими витреоретинальными заболеваниями 4,5. Следовательно, пациентам с симптомами увеита требуется диагноз для подтверждения или исключения VRL.
Недавно были опубликованы консенсусные критерии диагностики VRL, которые включают в себя комбинацию клинического обследования и лабораторных данных6. Образцы, обычно используемые для диагностики VRL, включают стекловидное тело и, в последнее время, водянистую влагу7. Стекловидное тело получают с помощью хирургической процедуры, называемой витрэктомией pars plana, которая обеспечивает доступ к заднему сегменту глаза8.
В представленном протоколе были отобраны образцы водянистой влаги и стекловидного тела для клеточной экстракции и экстракции cfDNA. После обезболивания пациентов и размещения троакаров на расстоянии примерно 4 мм от лимба роговицы с помощью туберкулинового шприца объемом 1 мл в лимбе роговицы был получен образец водянистой влаги объемом около 100-200 мкл. Для псевдофакичных пациентов неразбавленное стекловидное тело получали путем введения в инфузию стерильного воздуха, что позволяло собирать большее количество неразбавленного стекловидного тела (до 3,5 мл). У факичных пациентов перед включением инфузии сбалансированного солевого раствора удаляли примерно от 500 до 1000 мкл неразбавленного стекловидного тела. В некоторых случаях вторично разбавленное стекловидное тело (от 500 до 2000 мкл) собирали путем переключения инфузии на жидкость и помещения витректора в юбку стекловидного тела для получения этого образца. Наиболее разбавленная фракция стекловидного тела была собрана путем сохранения кассетного пакета (дополнительный рисунок 1) в конце операции. После того, как этот мешок попадал в патологоанатомическое отделение, разбавленное стекловидное тело получали путем слива жидкости из этого мешка в конические пробирки для последующей экстракции ДНК.
Цитопатология стекловидного тела часто считается золотым стандартом9. Тем не менее, несколько исследований продемонстрировали ограниченную чувствительность из-за обработки и минимальной клеточности10,11,12. Проточная цитометрия может помочь в идентификации клональных В-клеток, но также может быть ограничена низкой клеточностью и хрупкостью крупных клеток лимфомы13,14,15. Как цитопатология, так и проточная цитометрия требуют неповрежденных цельных клеток. Многие из этих клеток разрушаются во время сбора, хранения и переработки. Когда молекулярное тестирование проводится с использованием ДНК, извлеченной из интактных клеток (клеточная ДНК), оно страдает от того же ограничения. Кроме того, разделение ограниченного образца стекловидного тела для всех этих тестов уменьшает количество материала, доступного для каждого теста.
Внеклеточная ДНК (cfDNA) представляет собой еще один источник ДНК, который не требует интактных клеток. cfDNA из образцов стекловидного тела была использована для выявления VRL 16,17, а также увеальной меланомы18. В этом протоколе клеточная и внеклеточная ДНК извлекается из стекловидного тела и водной жидкости для обнаружения VRL.
Protocol
Representative Results
Discussion
Витреоретинальная лимфома (VRL) представляет собой агрессивную крупноклеточную В-клеточную лимфому 1,2,3, симптомы которой могут имитировать другие витреоретинальные заболевания 4,5. Молекулярное тестиров…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Тимоти Дэниелс (Timothy Daniels), MLS (ASCP), MB, QLS, и Хельмут Вайгелин (Helmut Weigelin), MLS (ASCP), сыграли важную роль в создании этого метода экстракции в нашей лаборатории.
Materials
| 2-Propanol (Isopropanol) | Fischer | A415-500 | |
| DNA Clean & Concentrator-10 | Zymo Research | D4011 | |
| DNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | D4003 | |
| Gentra Puregene Cell Lysis Solution | Qiagen | 158906 | |
| Gentra Puregene DNA Hydration Solution | Qiagen | 158916 | |
| Gentra Puregene Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P-4417 | |
| Quick-DNA Urine Kit | Zymo Research | D3061 | Conditioning buffer; also includes clearing beads, Proteinase K and spin columns |
| Ultrapure Glycogen, 20 µg/µL (20 mg/mL) | Thermo Fisher/Invitrogen | 10814010 |
References
- Chan, C. C., et al. Primary vitreoretinal lymphoma: a report from an International Primary Central Nervous System Lymphoma Collaborative Group symposium. Oncologist. 16 (11), 1589-1599 (2011).
- Sagoo, M. S., et al. Primary intraocular lymphomas. Clinical & Experimental Ophthalmology. 59 (5), 503-516 (2014).
- Coupland, S. E., Damato, B. Understanding intraocular lymphomas. Clinical & Experimental Ophthalmology. 36 (6), 564-578 (2008).
- Cassoux, N., et al. Ocular and central nervous system lymphoma: clinical features and diagnosis. Ocular Immunology and Inflammation. 8 (4), 243-250 (2000).
- Read, R. W., Zamir, E., Rao, N. A. Neoplastic masquerade syndrome. Survey Ophthalmology. 47, 81-124 (2002).
- Carbonell, D., et al. Consensus recommendations for the diagnosis of vitreoretinal lymphoma. Ocular Immunology and Inflammation. 23 (3), 507-520 (2021).
- Demirci, H., et al. Aqueous humor-derived MYD88 L265P mutation analysis in vitreoretinal lymphoma: a potential less invasive method for diagnosis and treatment response assessment. Ophthalmology Retina. 7 (2), 189-195 (2023).
- Machemer, R., Buettner, H., Norton, E. W., Parel, J. M. Vitrectomy: a pars plana approach. Transactions – American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 75 (4), 813-820 (1971).
- Vogel, M. H., Font, R. L., Zimmerman, L. E., Levine, R. A. Reticulum cell sarcoma of the retina and uvea. Report of sex cases and review of the literature. American Journal of Ophthalmology. 66 (2), 205-215 (1968).
- Kimura, K., Usui, Y., Goto, H. Japanese intraocular lymphoma study group. clinical features and diagnostic significance of the intraocular fluid of 217 patients with intraocular lymphoma. Japanese Journal of Ophthalmology. 56 (4), 383-389 (2012).
- Davis, J. L., Miller, D. M., Ruiz, P. Diagnostic testing of vitrectomy specimens. American Journal of Ophthalmology. 140 (5), 822-829 (2005).
- Char, D. H., Ljung, B. M., Miller, T., Phillips, T. Primary intraocular lymphoma (ocular reticulum cell sarcoma) diagnosis and management. Ophthalmology. 95 (5), 625-630 (1988).
- Tanaka, R., et al. More accurate diagnosis of vitreoretinal lymphoma using a combination of diagnostic test results: a prospective observational study. Ocular Immunology and Inflammation. 30 (6), 1354-1360 (2022).
- Missotten, T., et al. Multicolor flow cytometric immunophenotyping is a valuable tool for detection of intraocular lymphoma. Ophthalmology. 120 (5), 991-996 (2013).
- Bertram, H. C., Check, I. J., Milano, M. A. Immunophenotyping large B-cell lymphomas. Flow cytometric pitfalls and pathologic correlation. American Journal of Clinical Pathology. 116 (2), 191-203 (2001).
- Bonzheim, I., et al. The molecular hallmarks of primary and secondary vitreoretinal lymphoma. Blood Advances. 6 (5), 1598-1607 (2022).
- Shi, H., et al. Clinical relevance of the high prevalence of MYD88 L265P mutated vitreoretinal lymphoma identified by droplet digital polymerase chain reaction. Ocular Immunology and Inflammation. 29 (3), 448-455 (2021).
- Bustamante, P., et al. Circulating tumor DNA tracking through driver mutations as a liquid biopsy-based marker for uveal melanoma. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 40 (1), 196 (2021).
