Um procedimento para extrair DNA livre de células do humor vítreo e aquoso para realizar estudos moleculares para o diagnóstico de linfoma vitreorretiniano é estabelecido aqui. O método oferece a capacidade de extrair simultaneamente o DNA do componente celular da amostra ou reservá-lo para testes auxiliares.
O linfoma vitreorretiniano (LVV) representa um linfoma agressivo, frequentemente categorizado como linfoma primário de grandes células B difuso do sistema nervoso central. Para o diagnóstico da LVR, são coletados espécimes como humor vítreo e, mais recentemente, humor aquoso. Os testes diagnósticos para VRL nesses espécimes incluem citologia, citometria de fluxo e teste molecular. No entanto, tanto a citopatologia quanto a citometria de fluxo, juntamente com o teste molecular usando DNA celular, necessitam de células inteiras intactas. O desafio está no fato de que o humor vítreo e aquoso normalmente tem baixa celularidade, e muitas células são destruídas durante a coleta, armazenamento e processamento. Além disso, esses espécimes apresentam dificuldades adicionais para testes moleculares devido à alta viscosidade do humor vítreo e ao baixo volume do humor vítreo e aquoso. Este estudo propõe um método para extração de DNA livre de células de espécimes vítreos e aquosos. Essa abordagem complementa a extração de DNA celular ou permite que o componente celular desses espécimes seja utilizado para outros métodos diagnósticos, incluindo citologia e citometria de fluxo.
O linfoma vitreorretiniano (LMR) é um linfoma agressivo associado ao linfoma difuso primário de grandes células B do sistema nervoso central1,2,3. A VRL é tipicamente fatal devido ao seu envolvimento no sistema nervoso central 1,2. Embora rara1,4, a VRL frequentemente apresenta sintomas semelhantes à uveíte posterior e outras doenças vitreorretinianas4,5. Consequentemente, os pacientes que apresentam sintomas de uveíte requerem um diagnóstico para confirmar ou descartar a VRL.
Recentemente, foram publicados critérios consensuais para o diagnóstico de VRL, que envolvem uma combinação de exame clínico e achadoslaboratoriais6. Espécimes comumente utilizados para o diagnóstico de VRL incluem humor vítreo e, mais recentemente, humor aquoso7. O humor vítreo é obtido através de um procedimento cirúrgico denominado vitrectomia pars plana, que permite o acesso ao segmento posterior do olho8.
No protocolo apresentado, espécimes de humor aquoso e vítreo foram coletados para extração celular e de cfDNA. Após anestesia dos pacientes e colocação de trocárteres a aproximadamente 4 mm do limbo corneano, obteve-se uma amostra de humor aquoso de aproximadamente 100-200 μL utilizando seringa tuberculínica de 1 mL no limbo corneano. Para os pacientes pseudofácicos, o vítreo não diluído foi obtido pela introdução de ar estéril na infusão, permitindo a coleta de maior quantidade de vítreo não diluído (até 3,5 mL). Em pacientes fácicos, aproximadamente 500 a 1000 μL de vítreo não diluído foram removidos antes de iniciar uma infusão de solução salina balanceada. Em alguns casos, o vítreo secundariamente diluído (500 a 2.000 μL) foi coletado trocando-se a infusão para fluido e colocando-se o vitrector dentro da saia vítrea para obter essa amostra. A fração vítrea mais diluída foi coletada preservando-se a bolsa (Figura 1 suplementar) ao final da cirurgia. Uma vez que essa bolsa chegava ao departamento de patologia, o vítreo diluído era obtido a partir da drenagem do líquido para fora dessa bolsa em tubos cônicos para posterior extração de DNA.
A citopatologia do líquido vítreo é frequentemente considerada padrão-ouro9. Entretanto, vários estudos têm demonstrado sensibilidade limitada devido ao processamento e à celularidade mínima10,11,12. A citometria de fluxo pode auxiliar na identificação de células B clonais, mas também pode ser limitada pela baixa celularidade e fragilidade das grandes células do linfoma13,14,15. Tanto a citopatologia quanto a citometria de fluxo requerem células inteiras intactas. Muitas dessas células são destruídas durante a coleta, armazenamento e processamento. Quando o teste molecular é realizado usando DNA extraído de células intactas (DNA celular), ele sofre dessa mesma limitação. Além disso, dividir o espécime vítreo limitado para todos esses testes reduz a quantidade de material disponível para cada teste.
O DNA livre de células (cfDNA) representa outra fonte de DNA que não requer células intactas. O cfDNA de espécimes vítreos tem sido utilizado para a detecção de VRL 16,17 e melanoma uveal18. Neste protocolo, DNA celular e livre de células são extraídos do líquido vítreo e aquoso para detectar VRL.
O linfoma vitreorretiniano (LMR) é um linfoma agressivo de grandes células B 1,2,3 cujos sintomas podem mimetizar outras doenças vitreorretinianas4,5. O teste molecular do humor vítreo e, mais recentemente, aquoso tornou-se um método crítico para fazer o diagnóstico de VRL ou descartá-lo. No entanto, esses fluidos são muito baixos em volume e muitas vezes têm b…
The authors have nothing to disclose.
Timothy Daniels, MLS(ASCP), MB, QLS, e Helmut Weigelin, MLS(ASCP) foram fundamentais para estabelecer este método de extração em nosso laboratório.
2-Propanol (Isopropanol) | Fischer | A415-500 | |
DNA Clean & Concentrator-10 | Zymo Research | D4011 | |
DNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | D4003 | |
Gentra Puregene Cell Lysis Solution | Qiagen | 158906 | |
Gentra Puregene DNA Hydration Solution | Qiagen | 158916 | |
Gentra Puregene Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P-4417 | |
Quick-DNA Urine Kit | Zymo Research | D3061 | Conditioning buffer; also includes clearing beads, Proteinase K and spin columns |
Ultrapure Glycogen, 20 µg/µL (20 mg/mL) | Thermo Fisher/Invitrogen | 10814010 |